Dissezione e cultura Explant della Allantois murino per l'analisi In Vitro di allantoico allegato

Summary

Descriviamo un test in vitro per allegato corio-allantoidea di modello, il primo passo nella formazione della placenta. Il protocollo dimostra la cultura dissezione ed espianto di murino allantoides su integrina α4β1 immobilizzato. Allegato allantoide viene valutato microscopicamente a intervalli di tempo predeterminati.

Abstract

La placenta è essenziale per la crescita e lo sviluppo degli embrioni dei mammiferi. Per questo motivo, numerose alterazioni genetiche e probabili insulti anche ambientali che disturbano lo sviluppo della placenta o funzione possono causare perdita iniziale di gravidanza nei topi e nell’uomo. Tuttavia, mancano semplice in vitro test per lo screening per i potenziali effetti sulla formazione della placenta. Qui, ci concentriamo sulla modellazione il primo e fondamentale passo nella formazione della placenta, che consiste dell’attaccamento del allantois di chorion. Descriviamo un metodo per valutare rapidamente l’attaccamento degli espianti allantoico su integrina α4β1 immobilizzato, che funge da un substrato chorio-mimetici. Questo approccio in vitro consente una valutazione qualitativa dell’allegato e diffondendo il comportamento di più allantoide espianti in diversi momenti consecutivi. Il protocollo può essere utilizzato per studiare l’effetto di mutazioni mirate del mouse, droghe o vari fattori ambientali che sono stati collegati alle complicanze della gravidanza o perdita fetale su allantoide allegato ex vivo.

Introduction

La placenta è indispensabile per la crescita embrionale e sviluppo nell’ambiente uterino. Esso costituisce l’interfaccia per ossigeno, metabolita e scambio di nutrienti tra la circolazione fetale e materna e anche funzioni come un organo endocrino e immunologico. Qualsiasi insulto endogena o esogena che altera lo sviluppo placenta può portare a ritardo di sviluppo intrauterino, perdita fetale o complicazioni di gravidanza, sia in topi ed in esseri umani¹. Mentre il numero di mutazioni mirate del mouse che causano fisiologia placenta anormale continua ad aumentare di², con 219 genotipi attualmente elencati nel sito Web del Mouse Genome Informatics (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), molti di questi fenotipi non sono ben compresi da un punto di vista meccanicistico. Oltre alle alterazioni genetiche, anticorpi monoclonali, farmaci, tossine, agenti patogeni, metaboliti in eccesso o vari agenti ambientali possono influenzare lo sviluppo della placenta e funzione^{3,4,5 , 6 , 7}. ancora, semplice in vitro dosaggi che modello passaggi critici nello sviluppo della placenta sono scarse.

Murino sviluppo placenta è iniziato nella prima metà, quando l’allantoide (il precursore dello sviluppo del cordone ombelicale) emerge dalla parte posteriore dell’embrione come un germoglio che cresce verso il corion⁸. Chorioadhesive cellule nello strato esterno del germoglio allantoico mediano l’allegato e la diffusione della allantois sulla superficie del corion (corio-allantoidea “fusione”). Il corion successivamente piega in villi in cui il sistema vascolare della allantois cresce per formare il labirinto, lo strato interno placenta, dove le sostanze nutrienti e l’ossigeno vengono scambiati tra sangue materno strettamente giustapposti sinusoidi e vasi embrionali^{9 ,10}.

L’attaccamento della allantois al corion è il passo iniziale e fondamentale nella formazione del labirinto, e difetti di questo processo sono tra le cause più comuni di mortalità embrionale in midgestation¹. Anche se un numero di mutanti del topo con stato descritto dove chorioallantoic allegato non riesce a verificarsi¹⁰, e il database MGI attualmente elenca 108 mutanti del topo che sono caratterizzati dalla fusione di corio-allantoidea anormale (http:// www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), l’interazione intercellulare tra vascolare delle cellule adesione molecule-1 (VCAM-1, espressa il mesoderma allantoico) e integrina α4β1 (espressa su corionico mesotelio, che è derivato da mesoderm extraembryonic) sembra essere indispensabile per chorioallantoic allegato e fusione^11,12,13. La macchiatura di Immunohistochemical di embrioni di selvaggio-tipo intero-monta ha dimostrato che VCAM-1 è espresso all’interno di due terzi distali del gambo allantoico al giorno circa embrionale (E) 7.5¹³ (1-4 fase somite), e che la sua espressione rimane elevato durante il collegamento corio-allantoidea e – fusion^11,12. Fallimento di allantoico attaccamento al corion viene in genere rilevata dalle analisi istologiche dei germogli di utero. Tuttavia, allantoide dimensioni sono fisiologicamente altamente variabile in mezzo e anche all’interno di cucciolate della stessa fase inerente allo sviluppo¹⁴e allantois possibile collegare solo il corion quando ha raggiunto una dimensione sufficiente per rendere il contatto fisico. Riflettendo questa variabilità naturale, corio-allantoidea allegato si svolge qualche tempo tra ~ E 8.0 e 9.0 E nell’uteroe una valutazione statisticamente affidabile di questo processo dall’istologia dipende pertanto l’analisi di un gran numero di conceptuses per ottenere abbastanza campioni presso lo stadio di sviluppo appropriato.

Qui, descriviamo un metodo per valutare allantoico allegato ex utero che è meno dipendente dalle dimensioni allantoide. Dimostriamo la dissezione di embrioni di topo e loro allantoides dalla uterina di topi incinta ~ 8 giorni post coitum del (dpc; dpc 0,5 indica il rilevamento di un plug vaginale), e la successiva cultura di allantoide espianti su α4β1 immobilizzato integrine. Questo metodo consente una valutazione rapida e funzionale l’allegato e diffondendo il comportamento degli espianti di allantoide multipli in parallelo e in diversi momenti successivi. Il protocollo può essere utilizzato per schermare per gli effetti di vari fattori ambientali, farmaci o mutazioni mirate su allantoide allegato ex vivo.

Protocol

Allevamento del mouse è stato approvato dalla Regierung Unterfranken, e tutte le analisi sono state effettuate in conformità con tutti i tedesco e Unione europea leggi e normative applicabili relative alla cura e utilizzo degli animali da laboratorio. 1. rivestimento di microtitolo piastre con integrina α4β1 per Ex Utero Allantois Explant cultura Ricostituire l’integrina α4β1 murino liofilizzato a 200 µ g/mL in soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS). D…

Representative Results

Questo protocollo descrive un metodo per isolare ed explant allantoides murino ex vivoe la valutazione qualitativa dell’allantoide attaccamento di integrina α4β1, un processo critico durante in vivo chorioallantoic fusione di dettagli. I risultati rappresentativi mostrati in Figura 1A–H illustrano i passaggi successivi di isolamento allantoide a partire dall’utero incinto. Tessuti materni che circondano …

Discussion

In presenza di siero, che è una fonte ricca di molecole pro-adesiva della matrice extracellulare quali fibronectina, allantoide espianti verranno prontamente collegato a vari in plastica, vetro o filtro superfici^9,16. Così, se lo scopo del test eseguito è quello di studiare in particolare l’effetto di una modificazione genetica o qualsiasi altro trattamento allegato allantoide per immobilizzato α4β1, è fondamentale per bloccare i siti di legame non specific…

Materials

C57BL/6J wildtype mice	The Jackson Laboratory	Stock No: 000664
70 % (v/v) Ethanol	VWR International	930031006
Standard pattern forceps	Fine Science Tools	11000-12	Forceps used to open the abdominal cavity.
Micro dissecting forceps	Fine Science Tools	11254-20	Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.
Fine scissors	Fine Science Tools	14094-11	Straight blades.
Spring scissors	Fine Science Tools	15012-12	Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.
Microspoon	Carl Roth	AT18.1	5 mm Spoon diameter.
Microtiter plates	ibidi	81501	We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 µL) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-a4b1-mediated binding to plastic.
10 cm dish	Nunc	150350	Sterile tissue culture dishes.
3.5 cm dish	Nunc	150288	Sterile tissue culture dishes.
Large orifice pipette tips	Biozym	VT0140X	Low binding pipette tips, 200 µL.
a4b1 integrin	R&D Systems	6054-A4	Murine a4b1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537	Without Ca2+ and Mg2+.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	PAN Biotech	P04-03600	The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO3 but no L-glutamine, which is added separately.
Penicillin/Streptomycin	Gibco (ThermoFisher Scientific)	15140-122	100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 µg/mL streptomycin) stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
L-Glutamine	PAN Biotech	P04-80100	100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw.
Fetal bovine serum	Biochrom	S 0115	We use heat-inactivated FBS (heated to 56 °C for 30 min with mixing to inactivate complement).
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7030	We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 µm pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 °C.
para-Formaldehyde	Carl Roth	0335.2	To make a formaldehyde solution in PBS, weigh para-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 °C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 °C for approximately four weeks.
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100	Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.
Normal goat serum	Sigma Aldrich	G9023	To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.
a-CD31 Antibodies	BD Biosciences	550274	Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.
Secondary goat anti-rat antibodies	Thermo Fisher	A-11006	Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.
Mowiol 4-88	Sigma Aldrich	81381	Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000
Labovert	Leitz	Labovert	Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.
M80	Leica Microsystems	M80	Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.
DM4000B	Leica Microsystems	DM4000B	Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.
Digital camera	JVC	KY-F75U	3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.
Confocal microscope	Leica Microsystems	SP5	Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.