検出のマーカーの抗真菌薬剤耐性のカンジダ glabrataの全ゲノム シーケンス
Summary
本研究は、カンジダ glabrataで抗真菌薬耐性遺伝子で突然変異の分析の全ゲノム配列を実装します。カプソファンギン、アゾールと 5-フルシトシン、耐性菌のC. glabrataは、方法論を説明するために配列されました。菌株の感受性プロファイルは、遺伝子に特定の変異パターンの有無と相関。
Abstract
カンジダ glabrata も急速に薬剤耐性、特にアゾールやカプソファンギンにつながる変異を取得できます。抵抗は体外臨床的障害にしばしば関連付けることが検出されると、遺伝の突然変異の同定が不可欠です。C. glabrata抗真菌薬抵抗性のゲノム広い分析の全ゲノム配列 (WGS) を使用しての可能性を検討しました。目的はめざしイネーブラーをされ、実装 WG の障壁とその効果を測定します。このペーパーは、重要品質管理チェックポイントと抗真菌薬に対する感受性の低下と関連する遺伝マーカーを検討する WG 方法論の重要なコンポーネントを説明します。また、データ分析の正確性とテストの時間の周りのターンを見積もっています。
12 臨床表現型の感受性とC. glabrata ATCC 株の 1 つは、抗真菌薬感受性試験により決定されました。これらの含まれている 3 つは、薬剤の最小発育阻止濃度の上昇を開発する 3 つの患者からのペアを分離します。2 つのペアで 2 番目はカプソファンギンに各開発ペア抵抗の分離します。3 番目のペアの 2 番目の分離 5 フルシトシンへの抵抗を開発しました。残りは菌株の感受性およびアゾール耐性で構成。5 フルシトシン、アゾール系 echinocandin 抵抗性遺伝子の一塩基多型 (SNPs) は、次世代シーケンシングによる WG による耐性菌で確認されました。 FKS1、 FKS2 CgPDR1、CgCDR1 、 FCY2などの遺伝子を同定した抗真菌薬抵抗性の非同義の SNPs。全体的にみて、約 75-fold の読み取りの深さカバレッジを参照ゲノムにマップされるC. glabrata分離株の WGS 読み取りの 98% の平均。納期も費用もサンガーに匹敵するシーケンス。
結論としては、 C. glabrataの WGS は複数 PCR/DNA シーケンシング反応を必要とせずに別の抗真菌薬クラスに耐性に関与する臨床的に重大な遺伝子変異を明らかに可能だった。これは薬剤耐性授与置換の同時検出法の臨床検査室で WGS 能力を確立に向けた前向きな一歩を表します。
Introduction
カンジダ glabrataは、抵抗、アゾールおよびもっと最近、カプソファンギン1,2,3種としての重要性をますます発生病原体です。異なり、二倍体のc. アルビカンス、 C. glabrataの半数体のゲノム変異を取得し、多剤耐性をより簡単に開発することができます。両方の薬剤クラスでも共同の抵抗は、4を報告しました。したがって、抗真菌薬感受性の初期評価とC. glabrataの薬剤耐性の検出は抗菌薬耐性1のドライバーを制限する抗真菌薬の管理のコンテキストのように正しい、ターゲットを絞った治療も重要,5,6。 耐性菌の抵抗性バイオ マーカーにリンクされている確証的突然変異の存在がまた処方を改善するための意思決定を迅速に検出する効率的なワークフローと臨床転帰を確立します。
抗真菌薬感受性は通常薬物のない成長と比較して微生物の成長に大幅な削減結果最低薬物濃度として定義されている最小発育阻止濃度 (MIC) を測定することによって評価されます。コントロール。臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) 欧州委員会抗菌薬の感受性テスト (EUCAST) に感受性のマイクの決定を行うために試験方法を標準化してより正確で一貫性のある7、 8。ただし、抗真菌のマイクのユーティリティはカプソファンギン、特に限られている特に厚生比較に関して、様々 な方法論と条件が使用される9。また echinocandin 治療、WT を区別することができないに応答にマイクの不確かな相関関係がある (または影響を受けやすい) FKS 変異 (echinocandin 耐性菌)10,11をかくまっているそれらから分離されました。験の単一遺伝子 Pcr とサンガーの可用性も薬剤耐性マーカーのシーケンスを設定して、結果の実現は頻繁により遅れている複数抵抗マーカー5,12の同時検出の欠如。したがって、全ゲノム シーケンスに基づく解析により、ゲノム内の異なる場所での耐性付与突然変異の同時検出は、現在の方法より重要な利点を提供しています。
全ゲノム シーケンス (WGS) は、流行中の病気の感染だけでなく、ゲノム全体のリスク評価と薬剤耐性細菌やウイルスの13のテストのアプローチを追跡する正常に実装されています。核酸塩基配列決定技術の最近の進歩した全ゲノム配列 (WGS) 病原体の臨床的に実用的な時間の周りのターンで技術的、経済的に可能。DNA の配列では、病原体の同定および微生物学研究所14,,1516で採用の他の方法上の重要な利点を提供しています。まず、高スループット、スピードと品質で普遍的なソリューションを提供します。シーケンスは、微生物のいずれかに適用することができ、ローカルまたは地域研究所で規模の経済を可能します。第二に、国家および国際レベルで比較に従う ‘将来’ 形式のデータが生成されます。最後に、医学の WGS の潜在的な有用性は、追加の臨床的および疫学的メタデータ17 を含む同等のデータ基地にリンクすることができます参照ゲノムを含むパブリック データ基盤の急速な成長によって補強されています、18。
最近の調査はCandida sppの臨床分離株の薬剤耐性マーカーの同定の WGS の有用性を示した。10,19,20します。 これは主に高スループット ベンチトップ シーケンサー、確立されたバイオインフォマティクス パイプラインおよび21,22のシーケンス処理のコストが低下の可用性。真菌 WGS のシーケンスは WGS が 1 回の実行で複数ゲノムのシーケンスをことができますサンガー優位。さらに、カンジダゲノムの WGS は特定の薬剤標的変異解析、遺伝的進化と臨床的に関連するシーケンス タイプ20,22,23の出現を追跡できます。最も重要なことは、本質的な耐性菌の場合は WGS は治療選択22,24前に耐性付与突然変異の早期発見に役立ちます。
ここでは、抗真菌剤の異なるクラスに薬剤耐性に関連する変異の WGS が有効なスクリーニングの可能性を調べた。エンドユーザーと診断真菌学研究室展望から WGS の実装のための方法論を提案します。我々 は、この分析の 3 つの分離を体外でカプソファンギンと 5 フルシトシンへの抵抗は次の抗真菌治療時間をかけて開発 3 つの独立した臨床例から培養のペアに含まれて。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究には、可能性、おおよそタイムライン、 C. glabrataの薬剤耐性の WGS 誘導検出精度が決定されます。ライブラリの準備とシーケンスのターンアラウンド ・ タイム (TAT) は 4 日、ワンツー日数分析結果報告だったこれは少なくとも同じような量 TAT 培養皿サンガーから感受性試金のための比較サンプル数の大幅増加によるシーケンスします。約 30-90 C. glabrataゲノム シーケンス ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、感染症・微生物学・公衆衛生学の中心によって支えられました。著者は、この研究のため他の資金を受信していません。著者は、専門家のアドバイスと支援全ゲノム シーケンス実験 Drs アリシア アーノット、ネイサン バッハマンと Ranjeeta メノンをありがとうございます。
Materials
| DensiCHECK Plus | BioMérieux Inc | K083536 | Densitometer used for McFarland readings |
| Sensititre YeastOne | TREK Diagnostic Systems, Thermo Scientific | YO10 | Commercial susceptibility assay plate with standard antifungal drugs. |
| Fisherbrand Disposable Inoculating Loops and Needles | Fisher Scientific, Thermo Fisher Scientific | 22-363-605 | Disposable plastic loops can be used directly from package. No flaming required. |
| Eppendorf Safe-Lock microcentrifuge tubes | Sigma Aldrich, Merck | T2795 | Volume 2.0 mL, natural |
| ZYMOLYASE 20T from Arthrobacter luteus | MP Biomedicals, LLC | 8320921 | Used for cell wall lysis of fungal isolate before DNA extraction |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Does 100 DNA extractions |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P7589 | Picogreen reagent referred to as fluorescent dye in the protocol. Includes Lambda DNA standard and picogreen reagent for assay. |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | Includes Box 1 and Box 2 reagents for 96 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 |
Index set A Index set B Index set C Index set D |
| NextSeq 500/550 High Output Kit v2 | Illumina | FC-404-2004 | 300 cycles, More than 250 samples per kit |
| NextSeq 500 Mid Output v2 Kit | Illumina | FC-404-2003 | 300 cycles, More than 130 samples per kit |
| PhiX Control Kit | Illumina | FC-110-3001 | To arrange indices from Index kit in order |
| TruSeq Index Plate Fixture Kit | FC-130-1005 | 2 Fixtures | |
| KAPA Library Quantification Kit for Next-Generation Sequencing |
KAPA Biosystems | KK4824 | Includes premade standards, primers and MasterMix |
| Janus NGS Express Liquid handling system | PerkinElmer | YJS4NGS | Used for DNA dilutions during sequencing |
| 0.8 mL Storage Plate | Thermo Scientific | AB0765B | MIDI Plate for DNA Library cleanup and normalisation |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for library purification |
| Magnetic Stand-96 | Thermo Fisher Scientific | AM10027 | Used for magnetic bead based DNA purification |
| OrbiShaker MP | Benchmark Scientific | BT1502 | 96-well plate shaker with 4 platforms |
| Hard Shell PCR Plate | BioRad | HSP9601 | Thin Wall, 96 Well |
| LightCycler 480 Instrument II | Roche | 5015278001 | Accomodates 96 well plate |
| Microseal 'B' PCR Plate Sealing Film, adhesive, optical | BioRad | MSB1001 | Clear 96-well plate sealers |
| CLC Genomics Workbench | Qiagen | CLCBio | Software for data analysis, Version 8 |
| NextSeq500 instrument | Illumina | Illumina | Benchtop Sequencer used for next generation sequencing |
Referências
- Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
- Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
- Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
- Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
- Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
- Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
- Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
- . Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , (2012).
- Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
- Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718 (2012).
- Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
- Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
- Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
- Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
- Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824 (2012).
- Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
- Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314 (2015).
- Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
- Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
- Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
- Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
- Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
- Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
- Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
- Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
- Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268 (2009).
- Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
- Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
- Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
- Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110 (2015).
- de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
- de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
- Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).
