À l’aide de CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier l’activité oncogénique de calréticuline mutante dans les cellules hématopoïétiques dépendant de Cytokine

Summary

Gène ciblé d’édition à l’aide de CRISPR/Cas9 a grandement facilité la compréhension des fonctions biologiques des gènes. Ici, nous utilisons la méthodologie CRISPR/Cas9 à des mutations de la calréticuline modèle de cytokine-dépendante des cellules hématopoïétiques afin d’étudier leur activité oncogénique.

Abstract

Répétitions de courtes palindromiques régulièrement dois‑je cluster (CRISPR) est un système de l’immunité adaptative chez les procaryotes qui a été réutilisée par les scientifiques pour générer des nucléases RNA-guidé, comme associés à CRISPR (AC) 9 pour génome eucaryote in situ d’édition. Génie de génome par Cas9 sert à efficace, robuste et facilement modifier les gènes endogènes dans beaucoup de lignées cellulaires de mammifères biomédical pertinents et d’organismes. Ici, nous montrons un exemple de la façon d’utiliser la méthodologie CRISPR/Cas9 pour comprendre la fonction biologique de mutations génétiques spécifiques. Nous modélisons la calréticuline (CALR) mutations dans des cellules de (Ba/F3) de pro-B charge interleukine-3 (mIL-3) par la remise du seul guide RNAs (sgRNAs) ciblant le locus Calr endogène dans la région spécifique où insertion ou délétion (indel ) CALR mutations se produisent chez des patients atteints de syndromes myéloprolifératifs néoplasmes (NPP), un type de cancer du sang. Les sgRNAs créer des cassures double brin (CDB) dans la région ciblée qui sont réparés par fin non homologue rejoindre (NHEJ) pour donner des indels de différentes tailles. Ensuite, nous utilisons le test de transformation cellulaire standard Ba/F3 pour comprendre l’effet de l’expression de niveau physiologique des mutations Calr sur transformation cellulaire hématopoïétique. Cette approche peut être appliquée à d’autres gènes pour étudier leur fonction biologique dans diverses lignées cellulaires de mammifères.

Introduction

CRISPR/Cas9 technologie a récemment révolutionné génome ciblé d’édition dans les organismes et les cellules vivantes. Il est devenu un outil extrêmement puissant pour la recherche biomédicale et est actuellement utilisé comme une voie potentielle pour le traitement de maladies génétiques¹. La base de tous les outils d’édition du génome s’appuie sur la création d’une nucléase induite par l’ADN double brin pause (DSB) au locus génomique à modifier. La CDB peut être réparées par non homologue fin-rejoindre (NHEJ) ou axés sur l’homologie réparation (HDR)^2,3. L’avantage de la nucléase Cas9 sur autre génome ingénierie nucléases, tels que les nucléases de doigt de zinc (ZFNs) et nucléases effecteur comme activateur de transcription (TAPS) est sa dépendance sur RNA afin de cibler la nucléase à une séquence d’ADN désirée, par rapport aux interactions protéine-ADN trouvées dans ZFNs et TALENs^2,3.

Après la découverte de la voie de la nucléase CRISPR/Cas9 comme un système immunitaire adaptatif dans les cellules procaryotes^4,5, beaucoup d’efforts ont été en adaptant la voie pour une utilisation dans les lignées cellulaires de mammifères et modèle organismes^{2, 3}. comme un outil d’édition de gène, la voie CRISPR/Cas9 utilise deux composantes principales : le Streptococcus pyogenes (Sp) dérivés Cas9 nucléase et sgRNAs ciblant le gène d’intérêt^2,3. Le sgRNA compose de 20 nucléotides que Cas9 direct à un site spécifique sur le génome à ARN-ADN nucléotide complémentarité^2,3. Le site de la cible de la sgRNA doit se situer tout près d’un protospacer motif adjacent (PAM) à la forme de 5′ NGG, qui est reconnu par la nucléase de SpCas9. Avec ces outils, Cas9 peuvent être adressées à n’importe quelle séquence d’ADN grâce à la conception sgRNAs qui ciblent la région d’intérêt. En outre Sp dérivé Cas9, il y a des variantes supplémentaires pour Cas9 avec des caractéristiques différentes selon l’application spécifique. Par exemple, il y a des variantes de Cas9 avec la plus grande spécificité pour le montage sur la cible ou capacité de clivage simple-brin ADN entaille^6,7. En outre, Cas9 catalytiquement inactif a récemment été développé pour régulation transcriptionnelle⁸. Maintenant les scientifiques ont utilisé le système CRISPR/Cas9 pour une variété d’applications, telles que le gène knockin et knockout pour étudier les fonctions biologiques des gènes⁹, de perte de fonction et de gain de fonction bibliothèque écrans¹⁰ et génétique génie du modèle organismes¹¹.

Dans ce protocole, nous combinons la méthodologie CRISPR/Cas9 avec le test de transformation cellulaire Ba/F3 pour comprendre la fonction biologique de CALR mutations. BA/F3 cellules sont une ligne de cellules hématopoïétiques dépendant IL-3 murine pouvant être rendus IL-3 indépendants sur l’expression de certains oncogènes tels que BCR-ABL^12/12. Afin de comprendre si la calréticuline mutante peut transformer des cellules de Ba/F3 à la cytokine croissance indépendante, nous ciblé exon 9 du locus Calr endogène à l’aide de CRISPR/Cas9 à introduire des mutations indel et puis s’est retiré IL-3 les cellules d’appliquer un pression de sélection positive, dans le but de récapitulant les mutations CALR gain de fonction trouvées chez les patients de NPP. Le protocole inclut la conception, le clonage et la livraison de sgRNAs, le développement de cellules exprimant stables Cas9 et dépistage CRISPR sur-cible gène édition. Ce protocole peut être appliqué à différents gènes et plusieurs lignes de cellules cytokine dépendant d’intérêt et est particulièrement utile dans la modélisation et l’étude de la fonction biologique des gènes impliqués dans le cancer.

Protocol

1. sgRNA Design à l’aide des outils en ligne13 Conception sgRNAs ciblant le gène d’intérêt à l’aide des outils disponibles gratuitement en ligne. Copiez et collez la séquence de référence NCBI du gène d’intérêt dans l’outil de web designer sgRNA Broad Institute : (http://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design).Remarque : Cet outil identifie les séquences sgRNA avec des sites de clivage dans les exons et ce…

Representative Results

À l’aide de la méthode décrite ici, l’objectif de cette expérience est d’étudier les effets fonctionnels de l’introduction de mutations indel au locus Calr endogène sur la transformation des cellules hématopoïétiques. Le système CRISPR/Cas9 est utilisé comme un outil pour créer des mutations Calr endogènes dans les cellules de Ba/F3. Deux sgRNAs ont été choisis pour cibler l’exon 9 du Calr (Figure 1), dans l…

Discussion

Nous démontrons l’utilisationdes CRISPR/Cas9 gène édition pour étudier la fonction biologique de CALR mutations dans les cellules hématopoïétiques. Le succès de ce protocole est fortement tributaire de plusieurs facteurs. Tout d’abord, il est important de savoir quels types de mutations peuvent être responsables du phénotype que l’on souhaite. Dans ce protocole, l’affichage est la transformation des cellules de Ba/F3 à mIL-3 l’indépendance et les types de mutations sont indels dans l’exon 9…

Materials

BsmBI	New England Biolabs	R0580L
Blasticidin	Sigma Aldrich	15025
Puromycin	Life Technologies	A1113803
Stbl3 cells	Life Technologies	C737303
TransIT-LT1	Thermo Fisher Scientific	MIR2300
Opti-MEM	Life Technologies	51985034
RPMI	Thermo Fisher Scientific	MT10040CV
DMEM	Thermo Fisher Scientific	10-017-CV
Fetal bovine serum (FBS)	Omega Scientific	FB-11
Penicillin/streptomycin/L-glutamine	Life Technologies	10378016
mIL-3	Peprotech	213-13
psPAX2	Addgene	N/A
pCMV-VSV-G	Addgene	N/A
pLX_TRC311-Cas9	Addgene	N/A
polybrene	Sigma Aldrich	H9268
pXPR-011	Addgene	N/A
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Genessee Scientific	25-507
TAE buffer	Thermo Fisher Scientific	FERB49
LentiGuide-Puro	Addgene	Plasmid #52963
PNK	New England Biolabs	M0201S
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S
PCR purification kit	Qiagen	28104
Miniprep kit	Qiagen	27104