CRISPR/Cas9 जीन संपादन का प्रयोग Cytokine निर्भर टेम कोशिकाओं में उत्परिवर्ती Calreticulin की Oncogenic गतिविधि की जांच करने के लिए
Summary
CRISPR/Cas9 का उपयोग कर लक्षित जीन संपादन बहुत जीन के जैविक कार्यों की समझ में मदद की है । यहां, हम cytokine-निर्भर टेम कोशिकाओं में मॉडल calreticulin उत्परिवर्तनों के लिए CRISPR/Cas9 पद्धति का उपयोग करने के लिए उनके oncogenic गतिविधि का अध्ययन करने के लिए ।
Abstract
संकुल नियमित रूप से एक अंतराल लघु palindromic दोहराता (CRISPR) prokaryotes में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली है कि वैज्ञानिकों द्वारा आरएनए-निर्देशित nucleases, जैसे CRISPR-संबद्ध (कैस) साइट के लिए विशिष्ट युकेरियोटिक जीनोम के लिए 9 उत्पंन करने के लिए पुनर्जीवित किया गया है संपादन. Cas9 द्वारा जीनोम इंजीनियरिंग कुशलता, आसानी से और मजबूती से कई बायोमेडिकल-प्रासंगिक स्तनधारी सेल लाइनों और जीवों में अंतर्जात जीन को संशोधित करने के लिए प्रयोग किया जाता है । यहां हम कैसे CRISPR/Cas9 पद्धति का उपयोग करने के लिए विशिष्ट आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के जैविक कार्य को समझने का एक उदाहरण दिखाते हैं । हम मॉडल calreticulin (CALR) murine interleukin में उत्परिवर्तनों-3 (मिल-3) आश्रित प्रो-बी (Ba/एकल गाइड RNAs (sgRNAs) के वितरण द्वारा कोशिकाओं विशिष्ट क्षेत्र में अंतर्जात CALR लोकस लक्ष्यीकरण जहां सम्मिलन और/या विलोपन (indel ) CALR उत्परिवर्तनों myeloproliferative ट्यूमर (सीपीसीबी), रक्त कैंसर का एक प्रकार के साथ रोगियों में होते हैं । sgRNAs डबल किनारा टूट जाता है (DSBs) में लक्षित क्षेत्र है कि गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ) के लिए विभिंन आकारों की indels देने के द्वारा मरंमत कर रहे है बनाएं । हम तो टेम सेलुलर परिवर्तन पर Calr उत्परिवर्तनों के शारीरिक स्तर की अभिव्यक्ति के प्रभाव को समझने के लिए मानक बीए/F3 सेलुलर परिवर्तन परख रोजगार । यह दृष्टिकोण अन्य जीनों के लिए लागू किया जा सकता विभिन्न स्तनधारी सेल लाइनों में उनके जैविक समारोह का अध्ययन करने के लिए.
Introduction
CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी हाल ही में रहने वाले कोशिकाओं और जीवों में लक्षित जीनोम संपादन क्रांति की है । यह जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए एक अत्यंत शक्तिशाली उपकरण बन गया है और वर्तमान में आनुवंशिक रोगों1की चिकित्सा के लिए एक संभावित एवेंयू के रूप में उपयोग किया जा रहा है । सभी जीनोम संपादन उपकरण के लिए आधार जीनोमिक लोकस में एक nuclease प्रेरित डीएनए डबल असहाय तोड़ (DSB) के निर्माण पर निर्भर करता है संशोधित किया जाना है । DSBs नॉन-मुताबिक़ एंड-जॉइनिंग (NHEJ) या समरूपता-निर्देशित मरंमत (HDR)2,3द्वारा सुधारा जा सकता है । ऐसे जस्ता फिंगर nucleases (ZFNs) और प्रतिलेखन उत्प्रेरक जैसे प्रभाव nucleases (TALENs) के रूप में अंय जीनोम इंजीनियरिंग nucleases, पर Cas9 nuclease का लाभ एक वांछित डीएनए अनुक्रम को nuclease लक्ष्यीकरण के लिए आरएनए पर अपनी निर्भरता है, तुलना प्रोटीन के लिए-डीएनए ZFNs और TALENs2,3में पाया बातचीत ।
prokaryotic कोशिकाओं में एक अनुकूली प्रतिरक्षा प्रणाली के रूप में CRISPR/Cas9 nuclease मार्ग की खोज के बाद4,5, बहुत प्रयास स्तनधारी सेल लाइनों और मॉडल जीवों2में उपयोग के लिए मार्ग ढालने में चला गया है, 3. जीन संपादन के लिए एक उपकरण के रूप में, CRISPR/Cas9 मार्ग दो मुख्य घटकों का इस्तेमाल करता है: स्ट्रेप्टोकोकस pyogenes (सपा) Cas9 nuclease और ब्याज2,3के जीन लक्ष्यीकरण sgRNAs व्युत्पंन । sgRNA 20 न्यूक्लियोटाइड के होते है कि आरएनए के माध्यम से जीनोम पर एक विशिष्ट साइट के लिए प्रत्यक्ष Cas9-डीएनए बेस जोड़ी complementarity2,3। sgRNA के लक्ष्य साइट 5 ‘ NGG, जो SpCas9 nuclease द्वारा मांयता प्राप्त है के रूप में एक protospacer आसंन आकृति (पाम) साइट के निकट झूठ चाहिए । इन उपकरणों के साथ, Cas9 sgRNAs डिजाइन द्वारा किसी भी डीएनए अनुक्रम के लिए निर्देशित किया जा सकता है कि ब्याज के क्षेत्र को लक्षित । एसपी व्युत्पन्न Cas9 के अलावा, विशिष्ट अनुप्रयोग के आधार पर विभिन्न सुविधाओं के साथ Cas9 के लिए अतिरिक्त वेरिएंट हैं. उदाहरण के लिए, पर लक्ष्य संपादन या डीएनए के लिए एकल-किनारा क्लीवेज क्षमता6,7के लिए उच्च विशिष्टता के साथ Cas9 वेरिएंट हैं । इसके अलावा, उत्प्रेरक निष्क्रिय Cas9 हाल ही में transcriptional विनियमन8के लिए विकसित किया गया है । वैज्ञानिकों ने अब ऐसे जीन knockin और नॉकआउट के रूप में आवेदनों की एक किस्म के लिए CRISPR/Cas9 प्रणाली का इस्तेमाल किया है जीन9के जैविक कार्यों का अध्ययन, हानि-समारोह और लाभ के समारोह पुस्तकालय स्क्रीन10 और आनुवंशिक मॉडल जीवों की इंजीनियरिंग11.
इस प्रोटोकॉल में, हम CRISPR/Cas9 पद्धति को बीए/F3 सेलुलर परिवर्तन परख के साथ गठबंधन के लिए CALR उत्परिवर्तनों के जैविक समारोह को समझते हैं । Ba/F3 कक्ष एक murine il-3 निर्भर टेम सेल लाइन है कि BCR-ABL12जैसे कुछ oncogenes की अभिव्यक्ति पर स्वतंत्र IL-3 गाया जा सकता है । आदेश में समझने के लिए कि उत्परिवर्ती calreticulin cytokine स्वतंत्र विकास के लिए बीए/F3 कोशिकाओं को बदल सकते हैं, हम अंतर्जात के एक्सॉन 9 लक्षित Calr/लोकस का उपयोग CRISPR उत्परिवर्तनों को लागू करने के लिए Cas9/ recapitulating लाभ के लक्ष्य के साथ सकारात्मक चयन दबाव, समारोह के CALR उत्परिवर्तनों सीपीसीबी रोगियों में पाया. प्रोटोकॉल डिजाइन, क्लोनिंग और sgRNAs के वितरण, स्थिर Cas9 व्यक्त कोशिकाओं के विकास और CRISPR के लिए स्क्रीनिंग पर लक्ष्य जीन संपादन शामिल हैं । इस प्रोटोकॉल अलग जीन और विभिंन cytokine ब्याज की सेल लाइनों पर निर्भर लागू किया जा सकता है और विशेष रूप से मॉडलिंग में मूल्यवान है और कैंसर में शामिल जीन के जैविक समारोह का अध्ययन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम CRISPR/Cas9 जीन संपादन के उपयोग के लिए टेम कोशिकाओं में CALR उत्परिवर्तनों के जैविक समारोह का अध्ययन प्रदर्शन । इस प्रोटोकॉल की सफलता के कई कारकों पर अत्यधिक निर्भर है । सबसे पहले, यह पता है कि उत्परिव…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम NIH (R01HL131835), एक Damon Runyon नैदानिक अंवेषक पुरस्कार और स्टार कैंसर कंसोर्टियम द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| BsmBI | New England Biolabs | R0580L | |
| Blasticidin | Sigma Aldrich | 15025 | |
| Puromycin | Life Technologies | A1113803 | |
| Stbl3 cells | Life Technologies | C737303 | |
| TransIT-LT1 | Thermo Fisher Scientific | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 51985034 | |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | MT10040CV | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 10-017-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Omega Scientific | FB-11 | |
| Penicillin/streptomycin/L-glutamine | Life Technologies | 10378016 | |
| mIL-3 | Peprotech | 213-13 | |
| psPAX2 | Addgene | N/A | |
| pCMV-VSV-G | Addgene | N/A | |
| pLX_TRC311-Cas9 | Addgene | N/A | |
| polybrene | Sigma Aldrich | H9268 | |
| pXPR-011 | Addgene | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Genessee Scientific | 25-507 | |
| TAE buffer | Thermo Fisher Scientific | FERB49 | |
| LentiGuide-Puro | Addgene | Plasmid #52963 | |
| PNK | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Miniprep kit | Qiagen | 27104 |
Referências
- DeWitt, M. A., et al. Selection-free genome editing of the sickle mutation in human adult hematopoietic stem/progenitor cells. Sci Trans Med. 8, 360 (2016).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 4, 347-355 (2014).
- Gaj, T., Gerbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31 (7), 397-405 (2013).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Wiedenheft, B., Samuel, S. H., Doudna, J. A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archea. Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).
- Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).
- Ran, F. A., et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).
- Larson, M. H., et al. CRISPR interference (CRISPRi) for sequence-specific control of gene expression. Nat Protoc. 8 (11), 2180-2196 (2013).
- Wang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 153 (4), 910-918 (2013).
- Kim, H. S., et al. CRISPR/Cas9-mediated Gene-knockout screens and target identification via Whole genome sequencing uncover host genes required for picornavirus infection. J Biol Chem. 10, 1074 (2017).
- Heckl, D., et al. Generation of mouse models of myeloid malignancies with combinatorial genetic lesions using CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Biotechnol. 32 (9), 941-946 (2014).
- Daley, G. Q., Baltimore, D. Transformation of an interleukin 3-dependent hematopoietic cell line by the chronic myelogenous leukemia-specific bcr/abl protein. Proc Natl Acad Sci USA. 85, 9312-9316 (1988).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nat Biotechnol. 32, 1262-1267 (2014).
- Brinkman, E. K., et al. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucl Acid Res. 42, e168 (2014).
- Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 369, 2379-2390 (2013).
- Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N Engl J Med. 369, 2391-2405 (2013).
- Elf, S., et al. Mutant Calreticulin requires both its mutant C-terminus and the thrombopoietin receptor for oncogenic transformation. Cancer Discovery. 6 (4), 368-381 (2016).
- Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell lines via CRISPR/Cas9. J. Vis. Exp. (95), e52118 (2015).
- Watanabe-Smith, K., et al. Analysis of acquired mutations in transgenes arising in Ba/F3 transformation assays: findings and recommendations. Oncotarget. 8, 12596-12606 (2017).
- Fu, Y., et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. NatBiotechnol. 32, 279-284 (2014).
