Expressão gênica em camadas de aleurona cevada bombardeado com maior Throughput de medição

Resumo

Um protocolo melhorado é apresentado para a medição transitória da expressão do gene do repórter construções nas células de aleurona de cevada após o bombardeio de partículas. A combinação de grãos automatizado moagem com ensaios enzimáticos de placa de 96 poços fornece alto throughput para o procedimento.

Resumo

A camada de aleurona de grãos de cevada é um importante modelo sistema para expressão gênica hormônio-regulada em plantas. Nas células de aleurona, genes necessários para a germinação ou desenvolvimento inicial de plântulas são ativados por Giberelina (GA), enquanto os genes associados com respostas de estresse são ativados pelo ácido abscísico (ABA). Os mecanismos de sinalização GA e ABA podem ser interrogados por introduzir construções de gene repórter em células de aleurona através do bombardeamento de partículas, com a expressão transitória resultante medida através de ensaios enzimáticos. Um protocolo melhorado é relatado que parcialmente automatiza e agiliza a etapa de homogeneização de grão e os ensaios enzimáticos, permitindo que a taxa de transferência significativamente mais do que os métodos existentes. Homogeneização das amostras de grãos é realizada usando um homogeneizador de automatizado, e ensaios de GUS (β-glucuronidase) são realizados através de um sistema de placa de 96 poços. Resultados representativos, usando o protocolo sugerem que a atividade da fosfolipase D pode desempenhar um papel importante na ativação da expressão do gene HVA1 pela ABA, através do fator de transcrição TaABF1.

Introdução

A camada de aleurona de cevada é um sistema bem estabelecido de modelo para o estudo da expressão gênica de hormônio-regulada em plantas¹. Em particular, um número de genes necessários para a germinação ou desenvolvimento inicial de plântulas é ativado por Giberelina (GA), enquanto os genes associados com respostas de estresse são ativados pelo ácido abscísico (ABA). O GA e ABA vias de sinalização estão interligados, como a expressão de alguns genes GA-ativado é inibida pela ABA e vice-versa¹.

Uma estratégia valiosa para a compreensão que do papel dos actores particulares na GA/ABA sinalização....

Protocolo

1. preparação do efetor e Gene repórter constrói

1. Construa construções efetoras que empregam um promotor constitutivo (por exemplo, milho ubiquitin, UBI) a expressão de unidade de um frame de leitura aberto desejado. Por exemplo, construa um plasmídeo que contém UBI::TaABF1 a expressão constitutiva forte de unidade de TaABF1⁵.
2. Construa construções de repórter que incluem o promotor, cuja actividade está a ser medido, colocados a montante de um frame de leitura aberto, tais como GUS. Por exemplo, construa um plasmídeo que contém HVA1::GUS para medir a expressão do promotor HVA1

Resultados

A técnica descrita aqui pode ser usada para introduzir qualquer teste de construção de gene em células de aleurona de grãos de cevada. O nível de expressão do gene de teste pode então ser convenientemente medidos (Figura 2). O protocolo de taxa de transferência superior descrito aqui grandemente aumenta a eficiência da moagem de sementes e etapas de ensaio enzima. Este método tem sido usado para avaliar a capacidade da transcrição fator TaABF1

Discussão

A introdução do gene effector constrói através do bombardeamento de partículas, seguido pela expressão transiente de construções de repórter é uma estratégia valiosa para dissecar o papel dos actores particulares na GA/ABA sinalização e no gene resultante hormônio-regulada expressão.
No entanto, os protocolos existentes para a realização de tais experiências em cevada aleurona células^2,3,4,5.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit Maxiprep de plasmídeo HP GeneElute Sigma		NA0310-1KT
UV-vis espectrofotômetro	Nanodrop	ND-1000
grãos de cevada do Himalaia	/	/	Uma variedade de cevada sem casca (armazene no escuro a 4° C)
succinato de sódio	Sigma	S2378	Reagente para solução de absorção
de cloreto de cálcio (di-hidratado)	Fisher	C79-500	para solução de absorção
	Solução de absorção caseira	/	20 mM de succinato de sódio, 20 mM de cloreto de cálcio, pH 5,0. Esterilize em autoclavagem antes de usar.
cloranfenicol	Sigma	C0378	Prepare uma solução estoque de 10 mg / mL em etanol a 70%.
vermiculita	Fisher	NC0430369	Usado para placas de vermiculita.
círculos de papel de filtro (90 mm)	Whatman	1001 090	Usado para vermiculita e para preparação de grãos pré-bombardeio
Placas de vermiculita		caseiras/	Adicione 50 mL de vermiculita a uma placa de Petri de vidro. Coloque um círculo de papel de 90 mm em cima da vermiculita. Autoclave.
fórceps (fino apontado)	Fisher	13-812-42	Usado para remover o tegumento de grãos de cevada.
fórceps (ponta ultrafina)	Fisher	12-000-122	Usado para remover o tegumento de grãos de cevada.
microportadores de ouro (1,6 μ m)	BioRad	1652264
macrotransportadores	BioRad	1652335
cloreto de cálcio (di-hidratado)	Fisher	C79-500	Prepare uma solução estoque de 2,5 M e armazene alíquotas de 1 mL a -20 graus C.
espermidina	Sigma	S0266	Prepare uma solução estoque de 100 mM e armazene 500 μ L alíquotas em -20° C (uso dentro de 2 meses).
discos de ruptura (1550 psi)	BioRad	1652331
telas de parada BioRad		1652336
suportes de macroportadores	BioRad	1652322
Sistema de entrega de partículas biolísticas	BioRad	PDS-1000/He
fosfato de sódio monobásico monohidratado	Sigma	S9638	Reagente para fosfato de sódio 1M pH 7,2
fosfato de sódio dibásico	Sigma	S9763	Reagente para fosfato de sódio 1M pH 7,2
1M fosfato de sódio pH 7,2	caseiro		Combine 6,9 g de fosfato de sódio monobásico monohidratado com 7,1 g de fosfato de sódio dibásico. Adicione água a 100 mL. Adicione NaOH para obter pH 7,2.
ditiotrietólito (DTT)	Sigma	43819	Dissolver em água a 1 M. Armazenar a -20° em alíquotas de 1 mL.
leupeptina	Sigma	L2884	Dissolver em água a 10 mg/ml. Armazene a -20°
C.glicerol	Sigma	G5516	Prepare uma solução a 50% em água.
Tampão de moagem	caseiro	/	Combine 10 mL de fosfato de sódio 1 M pH 7,2, 500 μ L de 1 M TDT, 100 μ L de 10 mg/mL de leupeptina e 40 mL de glicerol a 50%. Adicione água a 100 mL.
contas de aço inoxidável (5 mm)	Qiagen	69989
Tubos de 2,0 mL	Eppendorf	22363352	Este modelo específico de tubo é recomendado para uso com o homogeneizador.
homogeneizador de esferas (TissueLyser)	Qiagen	85210
Tubos de ensaio de vidro de 12 mm x 75 mm	Fisher
luciferina	Goldbio	LUCK-100	Prepare uma solução estoque de 25 mM e armazene alíquotas de 1 mL a -20 graus C.
ATP	Sigma	A7699	Prepare uma solução de estoque de 100 mM e armazene 250 μ L alíquotas em -20°  C.
Sigma	T1503	de base Tris	para sulfato de Tris 1M pH 7,7.
ácido sulfúrico	Sigma	258105	Reagente para 1M Tris sulfato pH 7,7.
1M Tris sulfato pH 7,7	caseiro		Dissolva 12,1 g de base Tris em 100 mL de água. Ajuste o pH para 7,7 com ácido sulfúrico.
cloreto de magnésio	Sigma	M9397	Dissolver em água a 2 M.
Tampão de Ensaio de Luciferase (LAB)	feito em casa	/	Combine 3 mL de 1 M Tris sulfato pH 7.7, 500 μ L de cloreto de magnésio 2 M, 1 mL de 1 M DTT e 200 μ L de 0,5 M EDTA. Adicione água a 50  Ml.
Mistura de Ensaio de Luciferase	feita em casa	/	Combine 15 mL de LAB, 800 μ L de 25 mM de luciferina, 200 μ L de 100 mM de ATP e 4 mL de água. Isso faz uma mistura de ensaio suficiente (20  mL) para 100 ensaios de luciferase.
luminômetro (Sirius)	Berthold	/
4-metilumbeliferil-β-D-glucuronídeo (MUG)	Goldbio	MUG1	Dissolver em DMSO a 100 mM.
azida de sódio	Sigma	S8032	Prepare uma solução estoque a 2% em água e armazene alíquotas de 1 mL a -20 graus C.
Placas de 96 poços (padrão)	Tampão
GUS	feito em casa	/	Combine 2,5 mL de MUG, 5 mL de fosfato de sódio 1 M pH 7,2, 400 μ L de 0,5 M EDTA, 1 mL de 1 M DTT, 100 μ L de 10 mg/ml de leupeptina, 20 mL de metanol e 1 mL de azida sódica a 2%. Adicione água a 100 mL.
Filme de vedação TempPlate	USA Scientific	2921-1000
placas de 96 poços (preto)	Costar	3916
carbonato de sódio	Sigma	S7795	Prepare uma solução de 200 mM em água.
4-metilumbelliferona	Sigma	M1381	Prepare um 100 μ M em água. Congele alíquotas de 1 mL a -20°  C.
leitor de fluouresence de microplacas	Bio-Tek	FLX-800

Reagente /Reagente / de ensaio Fisher 12565501