Oogénese nos mamíferos é conhecido por ser propenso a erro, especialmente devido à missegregation do cromossomo. Este manuscrito descreve métodos de preparação de cromatina espalhado para prófase rato, metáfase I e II-encenado oócitos. Estas técnicas fundamentais permitem o estudo de proteínas da cromatina-limite e a morfologia do cromossomo durante a ovogênese mamífera.
Técnicas de propagação de cromatina foram amplamente utilizadas para avaliar a localização dinâmica de várias proteínas durante a gametogênese, particularmente para a espermatogênese. Essas técnicas permitem para visualização dos padrões de localização de DNA e proteína durante eventos meióticos como cromossomos homólogos emparelhamento, synapsis e DNA de reparação. Enquanto alguns protocolos têm sido descritos na literatura, técnicas de propagação de cromatina geral usando oócitos mamíferos prófase são limitadas e difícil devido a hora de início da meiose em ovários fetais. Em comparação, espermatócitos prófase podem ser coletados de ratos machos juvenis com rendimentos mais elevados, sem a necessidade de microdissection. No entanto, é difícil obter uma população sincronizada pura de células em estágios específicos devido à heterogeneidade das populações meiótica e pós meiótica de células germinativas do testículo de jovens e adulto. Para fases posteriores da meiose, é vantajoso para avaliar oócitos passando por meiose I (MI) ou meiose II (MII), porque grupos de oócitos maduros podem ser colhidos em ratos fêmeas adultos e estimulados a retomar a meiose em cultura. Aqui, métodos para preparações de cromatina meiótica espalhar usando oócitos dissecado de fetal, neonatal e adultos ovários são descritos com demonstrações em vídeo de acompanhamento. Eventos de missegregation cromossomo em oócitos mamíferos são frequentes, particularmente durante MI. Estas técnicas podem ser usadas para avaliar e caracterizar os efeitos de mutações diferentes ou exposições ambientais durante várias fases da oogénese. Como existem diferenças distintas entre a ovogênese e espermatogênese, as técnicas descritas dentro são de valor inestimáveis para aumentar nossa compreensão da oogénese mamíferos e as características sexualmente dimórficas de cromossomo e proteína dinâmica durante a meiose .
Durante a espermatogênese, grandes ondas semisíncronas de meiose células germinativas são uma reposta rápida e continuamente, no testículo no início da puberdade e ao longo da vida adulta1. Em contraste com os machos, meiose em fêmeas é iniciada somente durante o desenvolvimento fetal. Após o nascimento, oócitos permanecem presos em um estágio de Dictióteno prolongada da prófase I com uma intacta vesícula germinal (GV; envelope nuclear) até a puberdade. No início da puberdade, um subconjunto de ovócitos ciclicamente são selecionados para sofrer o crescimento e maturação, marcando o início da retomada meiótica. Meiótica retomada em oócitos já crescidos manifesta-se pelo desaparecimento do GV em um processo conhecido como vesícula germinal avaria (GVBD). O oócito então sofre condensação cromossomo e segregação, seguido por extrusão de corpo polar. Oócitos tornar-se preso em cima de progressão para MII e são estimulados para completar a segunda e última divisão meiótica somente após a fertilização.
Fertilidade feminina é altamente dependente do sucesso da prófase meiótica eu progressão. Chave para isso é a formação de uma ligação física entre cromossomos homólogos, conhecido como o chiasmata, que é mediada pela reparação de quebras da cadeia dupla induzidas DNA (DSBs) através de de recombinação de cruzamento2. Este processo ocorre dentro do contexto de um andaime ricos em proteínas dinâmico, conhecido como o complexo de synaptonemáticos (SC) que se forma entre os cromossomos homólogos para facilitar sua sinapse3. A SC é uma estrutura tripartida do zipper-como que consiste de dois elementos laterais paralelos conectados por proteínas da região central que detém homologs juntos ao longo de reparo de ADN em curso. Antes da sinapse, precursores dos elementos laterais, chamados de elementos de axiais, formam-se entre irmã cromátides irmãs. Synaptonemáticos complexo proteínas tais como SYCP2 e SYCP3 formam elementos axiais que colocalize para os eixos de coesão cromátide-irmã durante a prófase inicial. Estes mais tarde serve como ligação locais para a proteína de filamento transversal, SYCP1, o que facilita a montagem do elemento central e sinapse entre homologs alinhado4. Em oócitos de rato, synapsis completa é indicado pela presença de 20 completamente sobreposição de trechos de SYCP3 e SYCP1, que podem ser visualizados usando cromatina espalhar os preparativos. Sinapse é concluído com a entrada no subestágio paquíteno, segundo o qual os crossovers maduros que estão destinados a chiasmata forma entre homologs estão decorados com mutL dímeros de homólogo (MLH1/3) para promover sua transformação precisos5,6 , 7. a manutenção estrutural dos complexos de cromossomos (SMC), incluindo cohesin, nà e o SMC5/6 complexos, são importantes para a regulação da dinâmica do cromossomo e estrutura em toda a meiose8,9, 10,11,12. Coletivamente, esses eventos garantir bi-orientação correta dos cromossomos homólogos para opostas polos do eixo após a desmontagem do SC.
O ciclo celular meiótico é um poderoso modelo para examinar os papéis de várias proteínas na manutenção do genoma devido a indução programada e subsequente reparação de DNA DSBs. Além disso, a meiose mamíferos é também um modelo relevante para o estudo das alterações epigenéticas e imprinting genômico13. No entanto, é tecnicamente difícil de avaliar esses eventos durante a meiose feminina, que terá lugar nos ovários fetais e Neonatais em mamíferos (Figura 1). Prófase, que pode ser dividida em 5 substages: leptonema, zygonema, pachynema, diplonema e Dictióteno. Aqui, descrevemos como isolar e distinguir entre fetais e Neonatais ovários e testículos (Figura 2). Adaptado de métodos anteriormente descritos, este manuscrito também descreve um protocolo (etapa 1), com vídeo de demonstração para a preparação da prófase meiótica feminino eu cromatina espalha14,15,16,17 . Quando acoplado com encontrava, como descrito nos passos 6-7, este protocolo permite análise microscópica detalhada da prófase eu eventos em oócitos.
A ovogênese é propenso a erros e eventos de missegregation do cromossomo durante a primeira divisão meiótica representam a fonte mais comum de doença genética na descendência18,19. Este manuscrito (etapa 2 do protocolo), descrevemos um protocolo no qual oócitos maduros GV-encenado são extraídos aprontados ovários de camundongos fêmeas adultos. Sob condições de apoia, já crescidos oócitos submeter-se independente de hormônio luteinizante retomada da meiose após isolamento e cultura20. Após retomada meiótica, oócitos progridem através da meiose, em seguida, prendam na metáfase II. Oócitos permanecem presos em metáfase II, a não ser fertilizado. Nas etapas 2 a 5, adaptamo-nos protocolos anteriormente relatados com vídeo de demonstração para descrever como coletar, cultura e preparar MI e MII oócitos por cromatina espalhar preparações21. Esta cromatina espalhando técnica permite encontrava clara de proteínas associadas com cromossomos. Além disso, esse protocolo também pode ser usado para distinguir entre cromossomos bivalentes e univalentes e ainda mais pode resolver a única irmã cromátides irmãs para facilitar a avaliação da ploidia de ovócitos. Portanto, além de revelar os padrões de localização de proteínas meióticas, esse protocolo também pode servir como uma ferramenta inestimável para elucidar as causas potenciais de missegregation do cromossomo durante MI e MII.
Preparações de propagação de cromatina permitem aos pesquisadores estudar cronologicamente fêmea mamífera meiose e a localização dinâmica das proteínas envolvidas. Os spreads de cromatina embrionário e neonatal permitem a análise detalhada dos eventos durante a prófase meiótica. Metáfase I e metáfase II propagações de cromatina podem ser usadas para distinguir a única irmã cromátides irmãs de emparelhado irmãs e cromossomos homólogos emparelhados, bem como avaliar a ploidia. Em comparação, o pro…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo NIGMS (R01GM11755) para P.W.J e por uma bolsa de subsídio de formação do Instituto Nacional de câncer (NIH) (CA009110) para G.H. e J.H.
10X Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Quality Biological | 119-069-161 | |
60 mm x 15 mm petri dishes | Denville | T1106 | |
35mm x 12mm petri dishes | Denville | T1103 | |
Fine forceps | VWR | 300-050 | |
Micro dissection scissors | Ted Pella | 1340 | |
Dissecting scissors, sharp tip, 41/2" | VWR | 82027-578 | |
Watch glass square 1 5/8 | Carolina Biological Supply Company | 742300 | Autoclave before each use |
Sucrose | Sigma | S8501 | |
Trisodium Citrate Dihydrate | Sigma | S1804 | |
EDTA | Sigma | E6758 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 646563 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
50x Protease Inhibitor | Roche | 11873580001 | Add to hypotonic buffer immediately before use |
Turberculin syringe with needle (1cc, 27 G x 1/2 in) | Becton, Dickinson (BD) | 309623 | |
Gold seal ultra frost glass slides (25X75mm, 1mm thick) | Thermo | 3063-002 | |
Super PAP pen, large (liquid blocker) | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 71310 | |
16% Paraformaldehyde aqueous | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 15710 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Detergent in manuscript |
Immuno stain moisture chamber | Evergreen | 240-9020-Z10 | |
Coplin jars | Fisher | 08-815 | |
Photo-flo 200 | Electron Microscopy Sciences (EMS) | 74257 | Wetting agent in manuscript |
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | G4877 | Store aliquots at -20C |
Human chorionic gonadotropin (HCG) | Sigma | C0434 | Store aliquots at -20C |
PYREX Spot Plates with nine concave cavities | Fisher | 13-748B | Autoclave before each use |
Glass capillary | Fisher | 22260943 | For making oocyte collection needles |
Brand Parafilm M | Sigma | BR701501 | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (3.2 mm inner diameter x 6.4 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5B | For making oocyte collection needles |
Latex rubber tubing (6.4 mm inner diameter x 11.1 mm outer diameter) | Fisher | 14-178-5D | For making oocyte collection needles |
Flexible silicone rubber nosepiece, hard plastic mouthpiece and 15 inches of latex tubing | Sigma | A5177-5EA | For making oocyte collection needles |
Mitutoyo micrometer head | Mituoyo | 150-208 | For making oocyte collection needles |
Syringe 5 mL | BD Biosciences | 309646 | For making oocyte collection needles |
Syringe filter 0.45 μm filter | Corning | 431220 | For making oocyte collection needles |
Glass Pasteur Pipette 5 3/4" | Fisher | 13-678-6A | For making oocyte collection needles |
83 x 0.5 mm pipette tip | Denville | P3080 | For making oocyte collection needles |
α-MEM | Invitrogen | 11415049 | |
Waymouth's media | Life Technologies | 11220035 | |
Fetal bovine serum | Fisher | A3160602 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A3311 | For oocyte culture media |
500ml filter units 0.22um | Denville | F5227 | |
Hyaluronidase | Sigma | H3506 | |
Tyrode’s solution | Sigma | T1788 | Store aliquots at -20C |
Horse serum | Sigma | H-1270 | For ADB/wash buffer |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A1470 | For ADB/wash buffer |
VECTASHIELD antifade mounting medium with DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
Microscope cover slides (22mmx60mm) | Fisher | 12-544-G | |
Clear nail polish | Amazon | N/A | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Microscopes | |||
SteREO Discovery.V8 | Zeiss | 495015-0001-000 | |
Observer Z1 | Zeiss | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primary Antibodies | |||
Mouse anti-MLH1 | Life Technologies | MA5-15431 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti-SYCP1 | Life Technologies | PA1-16763 | Dilution factor- 1:1000 |
Goat anti-SCP3 | Santa Cruz | sc-20845 | Dilution factor- 1:50 |
Human anti-centromere protein | Antibodies Incorporated | 15-235 | Dilution factor- 1:100 |
Rabbit anti- TOPOII | Abcam | ab109524 | Dilution factor- 1:100 |
Mouse anti-Histone H4 (di methyl K20, tri methyl K20) | Abcam | ab78517 | Dilution factor- 1:500 |
Rabbit anti-Rec8 | Courtesy of Dr. Karen Schindler | N/A | Dilution factor- 1:10,000 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Secondary Antibodies | |||
Donkey anti-goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11057 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 488 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-21202 | Dilution factor- 1:500 |
Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 647 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-31573 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11004 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-Human IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo-Fisher Scientific | A-11013 | Dilution factor- 1:500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa Fluor 568 conjugate | Thermo-Fisher Scientific | A-11011 | Dilution factor- 1:500 |