To-dimensionelle gelelektroforese kombineret med massespektrometri metoder til analyse af menneskelige hypofyseadenom væv proteom
Summary
Her præsenterer vi en to-dimensionel gelelektroforese (2DE) kombineret med massespektrometri (MS) til at adskille og identificere menneskelige hypofyseadenom væv proteomet, som præsenterer en god og reproducerbare 2DE mønster. Mange proteiner er observeret i hver 2DE plet når analysere komplekse kræft proteomet med brug af høj-følsomhed MS.
Abstract
Menneskelige hypofyseadenom (PA) er en fælles tumor, der opstår i den menneskelige hypofyse hypothalamus-hypofyse-målrettet orgel akse systemer, og kan klassificeres som enten klinisk funktionelle eller nonfunctional PA (FPA og NFPA). NFPA er vanskeligt for tidlig fase diagnose og terapi på grund af knap opløftende hormoner i blodet i forhold til FPA. Vores langsigtede mål er at bruge proteomics metoder til at opdage pålidelige biomarkører for afklaring af PA molekylære mekanismer og anerkendelse af effektiv diagnostiske, prognostiske markører og terapeutiske mål. Effektive to-dimensionelle gelelektroforese (2DE) kombineret med massespektrometri (MS) metoder blev præsenteret her for at analysere menneskelige PA proteomes, herunder forberedelse af prøver, 2D gelelektroforese, protein visualisering, billedanalyse, i-gel Trypsin fordøjelse, peptid masse fingeraftryk (PMF) og tandem masse massespektrometri (MS/MS). 2-dimensionelle gel elektroforese matrix assisted laser desorption/Ionisation massespektrometri PMF (2DE-MALDI MS PMF), 2DE-MALDI MS/MS og 2DE-væskekromatografi (LC) MS/MS procedurer har været anvendt med succes i en analyse af NFPA proteomet. Med brug af et high-sensitivity massespektrometer, blev mange proteiner identificeret med 2DE-LC-MS/MS metoden i hver 2D gel spot i en analyse af komplekse PA væv til at maksimere dækningen af menneskelige PA proteomet.
Introduction
PA er en fælles tumor, der opstår i den menneskelige hypofyse hypothalamus-hypofyse-målrettet orgel akse systemer, som spiller en vigtig rolle i den menneskelige endokrine system. PA omfatter klinisk funktionelle og ikke-fungerende PAs (FPA og NFPA)1,2. NFPA er vanskeligt i tidlig fase diagnose og terapi på grund af kun lidt forhøjet hormonniveauer (f.eks., LH og FSH) i blodet i forhold til FPA, som har betydeligt øget niveauer af tilsvarende hormoner i blodet3,4 ,5. Afklaring af de molekylære mekanismer og opdagelsen af effektiv biomarkører har vigtige kliniske betydning i diagnose, behandling og prognose af NFPA. Vores langsigtede mål er at udvikle og bruge proteom metoder til at studere NFPA for opdagelsen af pålidelige biomarkører at præcisere sin molekylære mekanismer og genkende effektive terapeutiske mål samt diagnostiske og prognostiske markører. 2-DE kombineret med MS metoder har været flittigt brugt i vores langsigtet forskningsprogram vedrørende menneskelige PA proteomet1,2,6,7, herunder etablering af proteomet reference kort3,8, analyse af varierende udtrykt protein profiler9,10,11,12,13, hormon varianter14 ,15, posttranslationelle modifikationer såsom fosforylering14 og tyrosin nitrering16,17,18, proteom variation af invasive forhold til noninvasiv NFPAs19og proteom heterogenitet NFPA undertyper13, som førte til opdagelsen af flere vigtige pathway netværk (mitokondriel dysfunktion, celle cyklus dysregulering, oxidativ stress og MAPK signalering system abnormitet) der er ændret i NFPA13,19,20.
2DE adskiller proteiner ifølge deres isoelektriske punkt (pI) (isoelektrisk fokusering, IEF) og molekylvægt (via sodium dodecyl sulfat polyacrylamid gelelektroforese, SDS-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. Dette er en fælles og klassisk adskillelse teknik inden for proteomics, siden indførelsen af begreberne proteomet og proteomics i 199524. MS er den afgørende teknik for at finde ud af 2DE-adskilt proteiner, herunder PMF og MS/MS strategier identitet. Den meget hurtige udvikling af MS instrumenter, især i aspekter af påvisning følsomhed og opløsning, i kombination med forbedring af LC system, i høj grad forbedrer identiteten af lavt eller meget lavt overflod proteiner i en proteomet at maksimere den dækning af en proteomet. Det også udfordrer vores traditionelle begreber at kun én eller to proteiner er til stede i en 2D gel spot i en analyse af komplekse menneskelige væv proteomet og giver mulighed for at identificere flere proteiner i en 2D gel spot i en analyse af komplekse menneskelige væv proteom og maksimere dækningen af NFPA proteomet.
Her beskriver vi detaljerede protokoller af 2DE-MALDI MS PMF, 2DE-MALDI MS/MS og 2DE-LC-MS/MS, hvor held har været anvendt i analysen af menneskelige NFPA proteomet. Protokollerne, der omfatter forberedelse af prøver, først dimension (isoelektrisk fokusering, IEF), anden dimension (SDS-PAGE), visualisering af proteiner (sølv farvning og Coomassie blå farvning), image analyse af 2D gel, i-gel trypsin fordøjelse, rensning af tryptic peptider, PMF, MS/MS og database sviende3,8,25,26. Desuden, denne protokol nemt oversætter til analyse af andre humane væv proteomes.
Protocol
Representative Results
Discussion
2DE, kombineret med MS metoder herunder 2DE-MS PMF og 2DE-MS/MS, held har været anvendt i vores langsigtede program – brug af proteomics at studere menneskelige NFPA proteom variationer og molekylære netværk variationer for udredning af molekylære mekanismer og opdagelsen af effektiv biomarkører for NFPAs. 2DE-baserede sammenlignende proteomics med god reproducerbarhed spiller en vigtig rolle i identifikationen af NFPA proteom variationer9,10,<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation i Kina (Grant nr. 81572278 og 81272798 til XZ), tilskud fra Kina “863” planlægge projektet (Grant No. 2014AA020610-1 til XZ), Xiangya Hospital midler til Talent Introduktion (til XZ) og Hunan Provincial Natural Science Foundation i Kina (Grant No. 14JJ7008 til XZ). Forfatterne også anerkende den videnskabelige bidrag af Dr. Dominic M. Desiderio i University af Tennessee Health Science Center. X.Z. løbende udviklet og brugt 2DE-MS metoder til at analysere hypofyseadenom proteom fra 2001, udtænkt koncept for det foreliggende manuskript, skrev og revideret håndskriftet, koordineret de relevante arbejde og var ansvarlig for den økonomisk støtte og tilsvarende arbejde. Y.L. deltog i revisionen af håndskriftet. Y.H deltog i indsamling af referencer og revision af håndskriftet. Alle forfattere godkendt det endelige manuskript.
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
Referências
- Zhan, X., Wang, X., Cheng, T. Human pituitary adenoma proteomics: new progresses and perspectives. Front. Endocrinol. 7 (54), (2016).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Comparative proteomics analysis of human pituitary adenomas: Current status and future perspectives. Mass Spectrom. Rev. 24 (6), 783-813 (2005).
- Wang, X., Guo, T., Peng, F., Long, Y., Mu, Y., Yang, H., Ye, N., Li, X., Zhan, X. Proteomic and functional profiles of a follicle-stimulating hormone-positive human nonfunctional pituitary adenoma. Electrophoresis. 36 (11-12), 1289-1304 (2015).
- Karppinen, A., Kivipelto, L., Vehkavaara, S., Ritvonen, E., Tikkanen, E., Kivisaari, R., Hernesniemi, J., Setälä, K., Schalin-Jäntti, C., Niemelä, M. Transition from microscopic to endoscopic transsphenoidal surgery for nonfunctional pituitary adenomas. World Neurosurg. 84 (1), 48-57 (2015).
- Liu, X., Ma, S., Dai, C., Cai, F., Yao, Y., Yang, Y., Feng, M., Deng, K., Li, G., Ma, W., Xin, B., Lian, W., Xiang, G., Zhang, B., Wang, R. Antiproliferative, antiinvasive, and proapoptotic activity of folate receptor α-targeted liposomal doxorubicin in nonfunctional pituitary adenoma cells. Endocrinol. 154 (4), 1414-1423 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Pituitary adenoma nitroproteomics: current status and perspectives. Oxid. Med. Cell. Longev. 2013, 580710 (2013).
- Zhan, X., Wang, X., Desiderio, D. M. Mass spectrometry analysis of nitrotyrosine-containing proteins. Mass Spectrom. Rev. 34 (4), 423-448 (2015).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. A reference map of a pituitary adenoma proteome. Proteomics. 3 (5), 699-713 (2003).
- Desiderio, D. M., Zhan, X. A study of the human pituitary proteome: The characterization of differentially expressed proteins in an adenoma compared to a control. Cell. Mol. Biol. 49 (5), 689-712 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the human pituitary proteome. Clin. Chem. 49 (10), 1740-1751 (2003).
- Zhan, X., Evans, C. O., Oyesiku, N. M., Desiderio, D. M. Proteomics and tanscriptomics analyses of secretagogin down-regulation in human non-functional pituitary adenomas. Pituitary. 6 (4), 189-202 (2003).
- Moreno, C. S., Evans, C. O., Zhan, X., Okor, M., Desiderio, D. M., Oyesiku, N. M. Novel molecular signaling in human clinically non-functional pituitary adenomas identified by gene expression profiling and proetomic analyses. Cancer Res. 65 (22), 10214-10222 (2005).
- Zhan, X., Wang, X., Long, Y., Desiderio, D. M. Heterogeneity analysis of the proteomes in clinically nonfunctional pituitary adenomas. BMC Med. Genomics. 7, (2014).
- Zhan, X., Giorgianni, F., Desiderio, D. M. Proteomics analysis of growth hormone isoforms in the human pituitary. Proteomics. 5 (5), 1228-1241 (2005).
- Kohler, M., Thomas, A., Püschel, K., Schänzer, W., Thevis, M. Identification of human pituitary growth hormone variants by mass spectrometry. J. Proteome Res. 8 (2), 1071-1076 (2009).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. The human pituitary nitroproteome: detection of nitrotyrosyl-proteins with two-dimensional Western blotting, and amino acid sequence determination with mass spectrometry. Biochem. Biophys. Res. Commun. 325 (4), 1180-1186 (2004).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Nitroproteins from a human pituitary adenoma tissue discovered with a nitrotyrosine affinity column and tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 354 (2), 279-289 (2006).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Linear ion-trap mass spectrometric characterization of human pituitary nitrotyrosine-containing proteins. Int. J. Mass Spectrom. 259, 96-104 (2007).
- Zhan, X., Desiderio, D. M., Wang, X., Zhan, X., Guo, T., Li, M., Peng, F., Chen, X., Yang, H., Zhang, P., Li, X., Chen, Z. Identification of the proteomic variations of invasive relative to noninvasive nonfunctional pituitary adenomas. Electrophoresis. 35 (15), 2184-2194 (2014).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Signal pathway networks mined from human pituitary adenoma proteomics data. BMC Med. Genomics. 3, 13 (2010).
- O’Farrell, P. H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. J. Biol. Chem. 250 (10), 4007-4021 (1975).
- Klose, J., Kobalz, U. Two-dimensional electrophoresis of proteins: an updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis. 16 (6), 1034-1059 (1995).
- Zhan, X. Current status of two-dimensional gel electrophoresis and multi-dimensional liquid chromatography as proteomic separation techniques. Ann. Chromatogr. Sep. Tech. 1 (2), 1009 (2015).
- Wasinger, V. C., Cordwell, S. J., Cerpa-Poljak, A., Yan, J. X., Gooley, A. A., Wilkins, M. R., Duncan, M. W., Harris, R., Williams, K. L., Humphery-Smith, I. Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium. Electrophoresis. 16, 1090-1094 (1995).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Differences in the spatial and quantitative reproducibility between two second-dimensional gel electrophoresis. Electrophoresis. 24 (11), 1834-1846 (2003).
- Zhan, X., Desiderio, D. M. Spot volume vs. amount of protein loaded onto a gel. A detailed, statistical comparison of two gel electrophoresis systems. Electrophoresis. 24 (11), 1818-1833 (2003).
- Zhan, X., Zheng, W. Two-dimensional electrophoresis. Experimental Protocols for Medical Molecular Biology in Chinese and English. , 93-108 (2005).
- Westermeier, R. . Electrophoresis in Practice: A guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. , (1997).
- Zhan, X., Yang, H., Peng, F., Li, J., Mu, Y., Long, Y., Cheng, T., Huang, Y., Li, Z., Lu, M., Li, N., Li, M., Liu, J., Jungblut, P. R. How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?. Electrophoresis. , (2018).
