दो आयामी जेल मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद ऊतक Proteome के एक विश्लेषण के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री तरीकों के साथ युग्मित ट्रो
Summary
यहां, हम एक दो आयामी जेल ट्रो (2DE) मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) के साथ युग्मित करने के लिए अलग और मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद ऊतक proteome, जो एक अच्छा और reproducible 2DE पैटर्न प्रस्तुत की पहचान पेश करते हैं । उच्च संवेदनशीलता एमएस के उपयोग के साथ जटिल कैंसर proteome का विश्लेषण करते समय कई प्रोटीन प्रत्येक 2DE स्थान में मनाया जाता है ।
Abstract
मानव पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद (फिलीस्तीनी अथॉरिटी) एक आम ट्यूमर है कि hypothalamus-पिट्यूटरी-लक्षित अंग अक्ष प्रणालियों में मानव पिट्यूटरी ग्रंथि में होता है, और या तो नैदानिक कार्यात्मक या गैर-क्रियात्मक PA (FPA और NFPA) के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है । NFPA जल्दी चरण निदान और FPA की तुलना में रक्त में मुश्किल से हार्मोन के कारण चिकित्सा के लिए मुश्किल है । हमारी लंबी अवधि के लक्ष्य के लिए प्रोटियोमिक् तरीकों का उपयोग करने के लिए फिलीस्तीनी अथॉरिटी आणविक तंत्र और प्रभावी नैदानिक, शकुन मार्करों और चिकित्सीय लक्ष्यों की मांयता के स्पष्टीकरण के लिए विश्वसनीय मार्क्स की खोज है । प्रभावी दो आयामी जेल ट्रो (2DE) बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) तरीकों के साथ युग्मित यहां मानव PA proteomes, नमूनों की तैयारी, 2d जेल ट्रो, प्रोटीन दृश्य, छवि विश्लेषण, जेल में शामिल करने का विश्लेषण करने के लिए प्रस्तुत किया गया trypsin पाचन, पेप्टाइड मास फिंगरप्रिंट (PMF), और मिलकर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस/ 2-आयामी जेल ट्रो मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर desorption/ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री PMF (2DE-मालदी ms PMF), 2DE-मालदी एमएस/ms, और 2DE-लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (LC) ms/ms कार्यविधियाँ सफलतापूर्वक NFPA proteome के एक विश्लेषण में लागू किया गया है । एक उच्च संवेदनशीलता जन स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग के साथ, कई प्रोटीन जटिल पीए ऊतक के एक विश्लेषण में मानव PA proteome के कवरेज को अधिकतम करने के लिए प्रत्येक 2d जेल स्पॉट में 2DE-नियंत्रण रेखा के साथ एमएस/
Introduction
PA एक आम ट्यूमर है कि hypothalamus में मानव पिट्यूटरी ग्रंथि में होता है-पिट्यूटरी-लक्षित अंग अक्ष प्रणालियों, जो मानव अंत में स्रावी प्रणाली में महत्वपूर्ण भूमिका निभा. PA नैदानिक कार्यात्मक और क्रियात्मक क़दम (FPA और NFPA)1,2शामिल हैं । NFPA के प्रारंभिक चरण निदान और चिकित्सा में मुश्किल है क्योंकि केवल थोड़ा ऊंचा हार्मोन का स्तर (जैसे, LH, और FSH) रक्त में FPA की तुलना में, जो काफी वृद्धि हुई है रक्त में इसी हार्मोन का स्तर3,4 ,5. आणविक तंत्र और प्रभावी के निशान की खोज के स्पष्टीकरण निदान, चिकित्सा में महत्वपूर्ण नैदानिक महत्व है, और NFPA का पूर्वानुमान । हमारी दीर्घकालिक लक्ष्य को विकसित करने और proteomic तरीकों का उपयोग करने के लिए विश्वसनीय NFPA की खोज के लिए अपने आणविक तंत्र स्पष्ट करने के लिए अध्ययन है, और प्रभावी चिकित्सीय लक्ष्यों को पहचान के रूप में अच्छी तरह से नैदानिक और शकुन मार्करों । 2-डी एमएस तरीकों के साथ मिलकर बड़े पैमाने पर किया गया है हमारे दीर्घकालिक अनुसंधान मानव पीए proteome के बारे में कार्यक्रम1,2,6,7, proteome संदर्भ की स्थापना सहित मैप्स3,8, विभेदक व्यक्त प्रोटीन का विश्लेषण प्रोफाइल9,10,11,12,13, हार्मोन वेरिएंट14 ,15, पद-शोधों के संशोधनों जैसे फास्फारिलीकरण14 और tyrosine nitration16,17,18, इनवेसिव सापेक्ष के proteomic रूपांतर इनवेसिव NFPAs19, और NFPA उपप्रकार के proteomic विविधता13, जो कई महत्वपूर्ण मार्ग नेटवर्क की खोज के लिए नेतृत्व (mitochondrial शिथिलता, कोशिका चक्र dysregulation, ऑक्सीडेटिव तनाव, और MAPK संकेतन प्रणाली विषमता) है कि NFPA13,19,20में बदल रहे हैं ।
2DE प्रोटीन को उनके isoelectric पॉइंट (pI) (isoelectric focusing, आईईएफ) और आणविक भार के अनुसार अलग करता है (सोडियम dodecyl सल्फेट polyacrylamide जेल ट्रो, एसडीएस-PAGE)1,2,3, 4 , 5 , ६ , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23. यह प्रोटियोमिक् के क्षेत्र में एक आम और शास्त्रीय पृथक्करण तकनीक है, 1995 में proteome और प्रोटियोमिक् की अवधारणाओं की शुरूआत के बाद से24। एमएस PMF और एमएस सहित 2DE-अलग प्रोटीन की पहचान, बाहर खोजने के लिए महत्वपूर्ण तकनीक है/ विशेष रूप से पता लगाने संवेदनशीलता और संकल्प के पहलुओं में एमएस इंस्ट्रूमेंट्स के बहुत तेजी से विकास, नियंत्रण रेखा प्रणाली के सुधार के साथ संयोजन में, बहुत कम या बहुत कम बहुतायत में प्रोटीन की पहचान में सुधार एक proteome को अधिकतम करने के लिए एक proteome की कवरेज । यह भी हमारे पारंपरिक अवधारणाओं कि केवल एक या दो प्रोटीन जटिल मानव ऊतक proteome के एक विश्लेषण में एक 2d जेल स्थान में मौजूद है और एक जटिल मानव ऊतक के एक विश्लेषण में एक 2d जेल स्थान में कई प्रोटीन की पहचान करने का अवसर प्रदान करता है चुनौतियों proteome और NFPA proteome के कवरेज को अधिकतम ।
यहां हम 2DE के विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन-मालदी ms PMF, 2DE-मालदी एमएस/ms, और 2DE-LC-ms/ms जो सफलतापूर्वक मानव NFPA proteome के विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया है । प्रोटोकॉल नमूनों की तैयारी में शामिल हैं, पहले आयाम (isoelectric ध्यान केंद्रित, आईईएफ), दूसरा आयाम (एसडीएस-पृष्ठ), प्रोटीन के दृश्य (रजत धुंधला और Coomassie नीले दाग), 2d जेल की छवि विश्लेषण, जेल trypsin पाचन में, tryptic पेप्टाइड्स, PMF, एमएस/ms, और3,8,25,26को भेदने डाटाबेस का शुद्धिकरण । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल आसानी से अंय मानव ऊतक proteomes के विश्लेषण के लिए अनुवाद ।
Protocol
Representative Results
Discussion
2DE, 2DE सहित एमएस तरीकों के साथ युग्मित-ms PMF और 2DE-ms/एमएस, सफलतापूर्वक हमारी लंबी अवधि के कार्यक्रम में इस्तेमाल किया गया है-प्रोटियोमिक् के उपयोग के लिए मानव NFPA proteomic रूपांतरों और आणविक तंत्र के elucidation के लिए आणवि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम चीन की राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रांट no. ८१५७२२७८ और ८१२७२७९८ टू XZ) द्वारा समर्थित किया गया, चीन से अनुदान “863” योजना परियोजना (ग्रांट no. 2014AA020610-1 से XZ), प्रतिभा परिचय के लिए Xiangya अस्पताल कोष (XZ), और हुनान चीन के प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (ग्रांट No. 14JJ7008 टू XZ) । लेखक भी यूनिवर्सिटी ऑफ टेनेसी हेल्थ साइंस सेंटर में डॉ डोमिनिक एम Desiderio के वैज्ञानिक योगदान को स्वीकार करते हैं । X.Z. लगातार विकसित और इस्तेमाल किया 2DE-एमएस तरीके पिट्यूटरी ग्रंथ्यर्बुद proteome का विश्लेषण करने के लिए 2001 से शुरू, वर्तमान पांडुलिपि के लिए अवधारणा की कल्पना, लिखा और पांडुलिपि संशोधित, उचित काम समंवित, और के लिए जिंमेदार था वित्तीय सहायता और इसी काम करते हैं । Y.L. ने पांडुलिपि के पुनरीक्षण में भाग लिया । Y. H संदर्भ के संग्रह में भाग लिया, और पांडुलिपि के संशोधन । सभी लेखकों ने अंतिम पांडुलिपि को मंजूरी दी ।
Materials
| Ettan IPGphor 3 | GE Healthcare | isoelectric focusing system. | |
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALT II System | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | The vertical electrophoresis system | |
| Ettan IPGphor strip holder | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | ||
| Ettan DALTsix multigel caster | Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA | Multigel caster | |
| Voyager DE STR MALDI-TOF MS | ABI, Foster City,CA | MALDI-MS PMF | |
| MALDI-TOF-TOF | Autoflex III, Bruker | MALDI-MS/MS mass spectrometer | |
| LTQ-OrbiTrap Velos Pro ETD | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | ESI-MS/MS mass spectrometer | |
| EASY-nano LC system | Proxeon Biosystems, Odense, Denmark | High performance liquid chromatography system | |
| PepMap C18 trap column | 300 μm i.d. × 5 mm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| RP C18 column | 75 μm i.d., 15 cm length; Dionex Corp., Sunnyvale, CA, USA | ||
| KimWipe | Kimvipe | Insoluble paper towel | |
| Watter | Made by PURELAB flex instrument | ||
| Polytron Model P710/35 homogenizer | Brinkmann Instruments, Westbury, NY | ||
| PDQuest | Bio-Rad, Hercules, CA | 2D gel image analysis software | |
| SEQUEST | Thermo Proteome Discoverer 1.3 (version No. 1.3.0.339) | ||
| DataExplore (ver. 4.0.0.0) software | MS spectrum-processing software | ||
| Mascot software | PMF-based protein searching software | ||
| Mascot software | MS/MS-based protein searching software | ||
| Proteome Discoverer software v.1.3 beta | Thermo Scientific | ||
| Xcalibur software v.2.1 | MS/MS data-acquired management software | ||
| Uniprot version 201410.1_HUMAN.fasta | Human protein database | ||
| SEQUEST (version No. 1.3.0.339) | MS/MS-based protein searching software I | ||
| MASCOT (version 2.3.02) | MS/MS-based protein searching software II | ||
| C18 ZipTip microcolumn | Millipore | ||
| PeptideMass Standard kit | Perspective Biosystems | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| 2-D Quant Kit | GE Healthcare | 80-6483-56 | |
| BIS-ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0172 | |
| ACRYLAMIDE | AMRESCO | 0341 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Thiourea | Sigma-Aldrich | T8656 | |
| Urea | VETEC | V900119 | |
| SDS | AMRESCO | 0227 | |
| CHAPS | AMRESCO | 0465 | |
| TEMED | AMRESCO | M146 | |
| Ammonium Persulfate | AMRESCO | M133 | |
| Trypsin | Promega, Madison, WI, USA | V5111 | |
| IPG buffer pH 3-10, NL | GE Healthcare | 17-6000-87 | |
| Immobiline Dry Strip pH 3-10NL,18cm | GE Healthcare | 17-1235-01 |
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