Visualisation de la Formation de biofilms Candida albicans à l’aide d’un dispositif automatisé de microfluidique
Summary
Ce protocole décrit l’utilisation d’un dispositif microfluidique automatisées personnalisables pour visualiser la formation de biofilms de Candida albicans dans des conditions physiologiques hôte.
Abstract
Candida albicans est le plus commun champignon pathogène de l’homme, provoquant environ 15 % des cas de septicémie nosocomiales. Un attribut de virulence majeur de c. albicans est sa capacité à forme biofilms, les communautés structurées de cellules attachées aux surfaces biotiques et abiotiques. C. albicans biofilms peuvent se former sur les tissus de l’hôte, telles que les couches muqueuses et sur les dispositifs médicaux, tels que les cathéters, les stimulateurs cardiaques, les prothèses dentaires et prothèses conjointes. Biofilms posent des défis cliniques importants parce qu’ils sont très résistants aux perturbations physiques et chimiques et peuvent agir comme réservoirs de graines disséminées des infections. Divers essais in vitro ont été utilisés pour étudier la formation de biofilm de c. albicans , tels que des essais de plaque de microtitration, poids sec, les analyses de viabilité de cellules et microscopie confocale à balayage de laser. Tous ces tests sont essais de point d’arrêt simple, où la formation de biofilm est évaluée à un moment précis. Nous décrivons ici un protocole afin d’étudier la formation de biofilm dans en temps réel en utilisant un dispositif microfluidique automatisé dans des conditions d’écoulement laminaire. Cette méthode permet l’observation de la formation de biofilm comme le biofilm se développe au fil du temps, en utilisant des conditions personnalisables qui imitent ceux de l’hôte, telles que celles rencontrées dans les cathéters vasculaires. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer les défauts de biofilm de mutants génétiques ainsi que les effets inhibiteurs des agents antimicrobiens sur le développement du biofilm en temps réel.
Introduction
Candida albicans est membre commensaux de la flore humaine, mais c’est aussi un pathogène opportuniste, capable de causer des infections fongiques superficielles et sévère1,2. Un trait majeur de virulence de c. albicans est sa capacité à forme résilient et biofilms résistantes aux médicaments, les communautés de cellules ont adhéré à une surface et enfermé dans une matrice extracellulaire matière1,3. C. albicans biofilms sont très structurés, contenant plusieurs couches de plusieurs types de cellules (tour de bourgeonnement levure-forme des cellules, cellules pseudohyphes ovales et des cellules des hyphes tubulaires)4. C. albicans biofilms développement commence par l’adhérence des cellules de levure-forme ronde à une surface (semis du biofilm), suivie par la prolifération de ces cellules sur la surface, et puis la maturation du biofilm immature structurer dans un complètement formé des biofilms qui sont entouré d’un matériel de matrice extracellulaire4. Les biofilms à maturité est principalement composé de cellules des hyphes allongées qui forment des réseaux denses et d’interconnexion, fournissant la stabilité architecturale au biofilm4. Tout au long du cycle de vie de biofilm, autour de la levure de bière cellules quittent les biofilms à maturité et peuvent voyager dans d’autres régions du corps pour provoquer la diffusion des infections ou semences nouvelles biofilms autres sites4,5. C. albicans peuvent former des biofilms sur les surfaces biotiques, telles que des surfaces muqueuses et tout au long des tissus de l’hôte et sur des surfaces abiotiques, tels que les cathéters, les stimulateurs cardiaques, les prothèses dentaires et les prothèses articulaires. En raison des propriétés récalcitrantes des biofilms, ils sont extrêmement difficiles à éradiquer, et dans de nombreux cas la stratégie du seul traitement efficace est la suppression du dispositif infecté4. Il est donc crucial d’étudier la formation de biofilm dans des conditions similaires à celles observées en milieu clinique.
Il y a plusieurs critiques en vivo modèles animaux utilisés pour l’étude de c. albicans biofilm formation6,7,8; Toutefois, ces études peuvent être coûteux et fastidieux et sont limités par le nombre de souches et des agents antimicrobiens qui peuvent être testés à un moment donné. In vitro biofilm dosages, d’autre part, permettre l’évaluation rapide et à haut débit de composés antifongiques et souches mutantes et sont beaucoup plus rentables et éthiques que tests de biofilm transportés hors des animaux modèles9, 10,11,12,13,14. Nous décrivons ici un essai in vitro avec que nous avons développé et optimisé pour observer la formation de biofilm dans le temps sous flux laminaire en utilisant un microfluidique personnalisable appareil14,15. Le dosage permet la visualisation de chaque étape de la formation de biofilm, y compris l’étape initiale d’adhésion, la prolifération cellulaire, biofilm maturation et dispersion des cellules. L’essai est également utile pour visualiser les modifications de la morphologie cellulaire au cours du développement d’un biofilm.
Plaques de microtitration, qui sont généralement utilisés pour in vitro l’essais de biofilm, tout en haut débit, ne permettent pas pour des conditions d’écoulement contrôlé. Systèmes de piles à flux laminaire traditionnel permettent pour l’évaluation continue de la formation de biofilm dans des conditions d’écoulement contrôlé, mais ceux-ci sont souvent beaucoup de temps pour mettre en place et tendent à avoir limité le débit et contrôle de plage dynamique. Le dispositif microfluidique utilisé ici permet de surmonter ces limitations en combinant les plaques à haut débit (contenant 48 puits) avec une chambre à flux laminaire intégré et est hautement reproductible, polyvalent et personnalisable.
Nous décrivons ici un protocole pour l’utilisation d’un dispositif microfluidique automatisé disponible dans le commerce pour évaluer la formation de biofilm d’une sauvage c. albicans souche, les effets d’un agent antifongique connu sur le développement d’un biofilm et biofilm les défauts de formation dans deux souches mutantes (bcr1Δ/Δ et efg1 Δ/Δ) qui étaient préalablement déclarées avoir biofilm in vitro et in vivo16,17,18. Le protocole décrit peut être utilisé pour tester l’efficacité des agents antimicrobiens en inhibant la formation de biofilm au cours du développement d’un biofilm et d’identifier les gènes nécessaires pour le développement du biofilm normale de criblage des bibliothèques mutants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le dosage de biofilm microfluidique personnalisable décrit ici permet la visualisation de la formation de biofilm dans en temps réel à un niveau de cellule unique lorsqu’il est exposé à un taux fixe à flux laminaire et une température constante. Il constitue un moyen puissant pour étudier le développement des biofilms dans sauvage et les souches mutantes, et les effets des traitements d’agent antimicrobien sur les biofilms dans des conditions qui simulent les conditions physiologiques observés en milieu cli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions tous les membres du laboratoire Nobile pour discussions utiles sur des essais de biofilm. Cette étude a été financée par les instituts nationaux d’octroi de la santé (NIH) R21 AI125801 (au juge). D.L.R. était soutenue par une bourse de doctorat de l’University of California Institute pour le Mexique et les États-Unis (UC-MEXUS) et Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
Referências
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