Visualisering av Biofilm bildning i Candida albicans med en automatiserad mikroflödessystem enhet
Summary
Det här protokollet beskriver användningen av en anpassningsbara automatiserade mikroflödessystem enhet att visualisera biofilm bildning i Candida albicans värd fysiologiska villkor.
Abstract
Candida albicans är den vanligaste svamp patogen av människor, orsakar ca 15% av vårdrelaterade sepsis fall. Ett större virulens attribut av C. albicans är dess förmåga att bilda biofilmer, strukturerade samhällen av celler som bifogas biotiska och abiotiska ytor. C. albicans biofilmer kan bilda på värd vävnader, såsom slemhinnor skikt, och på medicinska enheter, till exempel katetrar, pacemakers, tandproteser och ledproteser. Biofilmer innebär betydande kliniska utmaningar eftersom de är mycket motståndskraftiga mot fysiska och kemiska störningar och kan agera som reservoarer för att utsäde sprida infektioner. Olika in vitro- analyser har använts för att studera C. albicans biofilm bildning, såsom mikrotiter plattan analyser, torr vikt mätningar, cell livskraft analyser och konfokalmikroskopi scanning laser. Alla av dessa analyser är enda slutpunkt analyser, där biofilm bildning bedöms vid en specifik tidpunkt. Här beskriver vi ett protokoll för att studera biofilm bildning i realtid med en automatiserad mikroflödessystem enhet laminär villkor. Denna metod tillåter för observationen av biofilm bildning som biofilmen utvecklas över tid, med anpassningsbara villkor som efterliknar de av värden, som de stött på i vaskulära katetrar. Detta protokoll kan användas för att bedöma de biofilm defekterna av genetiska mutanter samt de hämmande effekterna av antimikrobiella medel på biofilm utveckling i realtid.
Introduction
Candida albicans är en kommensaler medlem av den mänskliga bakterieflora, men det är också en opportunistisk patogen, kan orsaka ytliga och svår svampinfektioner1,2. En större virulens drag av C. albicans är dess förmåga att bilda motståndskraftiga och resistenta biofilmer, samhällen av celler följs en yta och inneslutna i en extracellulär matrix material1,3. C. albicans biofilmer är mycket strukturerad, som innehåller flera lager av flera celltyper (runda spirande jäst-form celler, oval pseudohyphal celler och tubulär hyphal celler)4. C. albicans biofilm utveckling börjar med anslutning runda jäst-form celler till en yta (sådd biofilmen), följt av spridningen av dessa celler på ytan och sedan mognaden av den omogna biofilmen struktur till en fullt bildade biofilm som är omgiven av extracellulärmatrix material4. Den mogna biofilmen består huvudsakligen av avlånga hyphal celler som bildar täta och anslutande nät, den arkitektoniska stabilitet till biofilm4. Under biofilm hela livscykel, runda spirande jäst celler skingra från den mogna biofilmen och kan resa till andra områden av kroppen för att orsaka spridas infektioner eller utsäde nya biofilmer på andra platser4,5. C. albicans kan bilda biofilmer på biotiska ytor, till exempel slemhinnorna och hela värden vävnad, och på abiotiska ytor, såsom katetrar, pacemakers, proteser och proteskomponenter lederna. På grund av biofilmer motsträviga egenskaper, de är extremt svåra att utrota, och i många fall den enda effektiva behandlingsstrategin är avlägsnande av den infektera enheten4. Det är därför avgörande att undersöka biofilm bildning under förhållanden liknande dem som observerats i kliniska inställningar.
Det finns flera kritiska i vivo djurmodeller för att studera C. albicans biofilm bildning6,7,8. dock dessa studier kan vara kostsam och tidskrävande, och begränsas av antalet stammar och antimikrobiella medel som kan provas vid en given tidpunkt. In vitro biofilm analyser, däremot, möjliggör snabb, hög genomströmning bedömningen av svampdödande föreningar och muterade stammar och är mycket mer kostnadseffektiva och etiska än biofilm analyser buret ut i djur modeller9, 10,11,12,13,14. Här beskriver vi ett in vitro- test som vi utvecklat och optimerat för att observera biofilm bildning temporally under laminärt flöde med hjälp av en anpassningsbar mikroflödessystem enhet14,15. Analysen möjliggör visualisering av varje etapp av biofilm bildning, inklusive inledande följsamhet steg, cellproliferation, biofilm mognad och cell spridning. Analysen är också användbart att visualisera morfologi cellförändringar under utvecklingen av en biofilm.
Mikrotiter plattor, som vanligtvis används för in vitro- biofilm analyser, medan hög genomströmning, tillåter inte för kontrollerat flöde villkorar. Traditionella laminärt flöde cellsystem tillåter kontinuerlig bedömning av biofilm bildning i kontrollerat flöde villkor, men dessa är ofta tidskrävande att ställa in och tenderar att ha begränsat dynamiskt omfång kontroll och genomströmning. Mikroflödessystem enheten utnyttjas här övervinner dessa begränsningar genom att kombinera hög genomströmning plattor (innehållande 48 brunnar) med en inbyggd laminär kammare och är mycket reproducerbara, mångsidig och anpassningsbar.
Här beskriver vi ett protokoll för användning i ett kommersiellt tillgängliga automatiserade mikroflödessystem att bedöma biofilm bildning av en vild typ C. albicans stam, effekterna av en känd svampdödande agent på utvecklingen av en biofilm och biofilm bildning i två muterade stammar (bcr1Δ/Δ och efg1 Δ/Δ) som tidigare redovisats har biofilm defekter in vitro- och in-vivo16,17,18. Protokollet beskrivs kan användas för att testa effekten av antimikrobiella medel i att hämma biofilm bildning under utvecklingen av en biofilm, och att identifiera gener som krävs för normal biofilm utveckling av screening mutant bibliotek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anpassningsbara mikroflödessystem biofilm analysen beskrivs här möjliggör visualisering av biofilm bildning i realtid på en enda cellnivå när de utsätts för en fast ränta laminärt flöde och konstant temperatur. Det ger ett kraftfullt medel för att studera utvecklingen av biofilmer i vildtyp och muterade stammar och effekterna av antimikrobiellt medel behandlingar på biofilmer under förhållanden som efterliknar fysiologiska förhållanden observerade i kliniska inställningar. Till skillnad från de flesta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar alla medlemmar för Nobile lab för bra diskussioner om biofilm analyser. Denna studie stöddes av National Institutes of Health (NIH) grant R21 AI125801 (till C.J.N.). Tunnelbanestation stöddes av en doktorand stipendium från University of California Institute för Mexiko och Förenta staterna (UC-MEXUS) och Consejo Nacional de Ciencia y Technologia (CONACYT).
Materials
| BioFlux 1000z | Fluxion | Automated microfluidic device for live cell analysis | |
| 48-well plate 0-20 dyne | Fluxion | 910-0047 | Microfluidic plate |
| Montage Software | Fluxion | Version 7.8.4.0 | Visualization analysis software |
| ImageJ Software | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Yeast Extract | Criterion | C7341 | |
| Bacto Peptone | BD Biosciences | 211677 | |
| Dextrose (D-Glucose) | Fisher Scientific | D163 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | P285-500 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R6504 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M3183 | |
| Nutrient Broth | Criterion | C6471 | |
| Difco D-Mannitol | BD Biosciences | 217020 | |
| Agar | Criterion | C5001 | |
| Amphotericin B | Corning | 30-003-CF | |
| Sterile Inoculating Loops | VWR | 30002-094 | |
| Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Disposable Cuvettes | Fisher Scientific | 14-955-127 | |
| Lens Paper | VWR | 52846-001 | |
| Microplate and Cuvette Spectrophotometer | BioTek | EPOCH2TC | |
| Shaking Incubator | Eppendorf | M12820004 |
Referências
- Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annu Rev Microbiol. 69, 71-92 (2015).
- Kojic, E. M., Darouiche, R. O. Candida infections of medical devices. Clin Microbiol Rev. 17 (2), 255-267 (2004).
- Fox, E. P., Nobile, C. J., Dietrich, L. A., Friedmann, T. S. . Candida albicans: Symptoms, Causes and Treatment Options. , 1-24 (2013).
- Gulati, M., Nobile, C. J. Candida albicans biofilms: development, regulation, and molecular mechanisms. Microbes Infect. 18 (5), 310-321 (2016).
- Uppuluri, P., et al. Dispersion as an important step in the Candida albicans biofilm developmental cycle. PLoS Pathog. 6 (3), e1000828 (2010).
- Andes, D., et al. Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infect Immun. 72 (10), 6023-6031 (2004).
- Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., Andes, D. R. Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infect Immun. 78 (9), 3650-3659 (2010).
- Nett, J. E., et al. Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm infection. Infect Immun. 82 (12), 4931-4940 (2014).
- Krom, B. P., Willems, H. M. In Vitro Models for Candida Biofilm Development. Methods Mol Biol. 1356, 95-105 (2016).
- Hawser, S. P., Douglas, L. J. Biofilm formation by Candida species on the surface of catheter materials in vitro. Infect Immun. 62 (3), 915-921 (1994).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45 (9), 2475-2479 (2001).
- Nett, J. E., Cain, M. T., Crawford, K., Andes, D. R. Optimizing a Candida biofilm microtiter plate model for measurement of antifungal susceptibility by tetrazolium salt assay. J Clin Microbiol. 49 (4), 1426-1433 (2011).
- Krom, B. P., Cohen, J. B., McElhaney Feser, G. E., Cihlar, R. L. Optimized candidal biofilm microtiter assay. J Microbiol Methods. 68 (2), 421-423 (2007).
- Lohse, M. B., et al. Assessment and Optimizations of Candida albicans In Vitro Biofilm Assays. Antimicrob Agents Chemother. 61 (5), (2017).
- Winter, M. B., et al. Global Identification of Biofilm-Specific Proteolysis in Candida albicans. mBio. 7 (5), (2016).
- Nobile, C. J., et al. A recently evolved transcriptional network controls biofilm development in Candida albicans. Cell. 148 (1-2), 126-138 (2012).
- Fox, E. P., et al. An expanded regulatory network temporally controls Candida albicans biofilm formation. Mol Microbiol. 96 (6), 1226-1239 (2015).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Curr Biol. 15 (12), 1150-1155 (2005).
- Baker, K. . At the bench: A laboratory navigator. 27, (2005).
