Summary

Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей

Published: January 06, 2018
doi:

Summary

В этой статье мы представляем методы изоляции и дифференцировать стромальных клеток костного мозга и стволовых гемопоэтических клеток от мыши длинных костей. Две различные протоколы представлены приносит различных клеточных популяций, пригодных для расширения и дифференцировку в остеобластов, адипоциты и остеокласты.

Abstract

Клетки стромы костного мозга (BMSCs) являются популяции клеток, обычно используется как представление мезенхимальных стволовых клеток в пробирке. Они находятся внутри полости костного наряду с гемопоэтических стволовых клеток (СКК), которые могут породить красные кровяные клетки, иммунных прародителями и остеокласты. Таким образом экстракции популяции клеток из костного мозга результатов в весьма разнородный набор различных клеточных популяций, которые могут представлять вызовы в экспериментальный дизайн и смешаем интерпретации данных. Несколько изоляции и культуры методы были разработаны в лабораториях для того чтобы получить более или менее однородной популяции BMSCs и СКК Инвитро. Здесь мы представляем два метода для изоляции BMSCs и СКК от мыши длинных костей: один метод, который дает смешанное население BMSCs и СКК и один метод, который пытается разделить два клеточных популяций на основе соблюдения. Оба метода предоставляют клетки для Остеогенные и адипогенном дифференциация экспериментов, а также функциональные анализы.

Introduction

Основная мышиных BMSCs обычно используются как модель в vitro мезенхимальных стволовых клеток с момента их открытия в начале 1980-х1. Действительно культуры клеток пластик сторонник, покраснел от полости костного длинных костей поддерживать способность быть продифференцированным в остеобластов, остеокласты, хрящевые клетки или адипоцитов многих исследований в2,3, 4 , 5. Однако, костного мозга является уникальная ткань состоит из многих различных клеточных популяций, включая, но не ограничиваясь, BMSCs, СКК, эндотелия и иммунные клетки. Таким образом изоляции и культуры методы могут принести клеточных популяций с различными однородности. Использование таких методов для проверки потенциальных дифференциации от клеток может быть сложным. Например при сравнении клетки от мышей с различными генотипами, начиная с населением смешанного клеток ограничивает интерпретации данных. И наоборот, получение однородной популяции BMSCs и СКК может быть технически сложным и не может быть как представитель модели ex vivo .

В нашей лаборатории мы в первую очередь заинтересованы в использовании BMSCs из-за их потенциал быть продифференцированным остеобластов, остеокластов и адипоцитов. Здесь мы представляем методов изоляции BMSCs и СКК и культуры, используемые для оценки osteoblastogenesis или adipogenesis в vitro, а также культур СКК дифференцироваться в остеокластов. Один метод использует смешанное население клеток костного мозга (BMC), содержащие BMSCs и СКК непосредственно подходит для adipogenesis, osteoblastogenesis и osteoclastogenesis (так называемый общий BMC). Этот метод является ex vivo представление ближе гетерогенности среди клеток костного мозга микроокружения. Другой метод отделяет приверженца от non сторонник клеток в попытке «чище» населения культуры BMSCs и СКК (называемых приверженцев BMSCs). Более поздних метод позволяет культуры клеток экспериментов, чтобы начать с более точное количество BMSCs или СКК и уменьшает потенциал комплекса косвенные эффекты других клеточных популяций, которые остаются в культуре. Оба метода были ранее опубликованы и используется для решения различных исследовательских вопросов6,,78,9.

Protocol

Все экспериментальные процедуры были утверждены институциональный уход животных и использование Комитета Мэн медицинский центр научно-исследовательском институте. 1. Коллекция трубок подготовка Сделать BMSC Культура СМИ, дополняющего минимум основных средних α (MEM…

Representative Results

Обзор культур клетокДве культуры методы позволяют оценки дифференциации по смешанным населением BMC, состоящая из BMSCs и СКК (всего BMC, рис. 1A) или совокупность BMSCs отделилась от СКК (сторонник BMSCs, рис. 1B). 48 ч после того, как клетки…

Discussion

В этой статье представлены два метода культуры BMSCs с их преимущества и ограничения. Изоляции клеток из костного мозга является относительно легким процессом. Однако получение популяции клеток, представитель мезенхимальных стволовых клеток или osteoclastic прародителями может быть сложным …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения (R01 AR061164-01A1).

Materials

200μL pipet tips  Rainin 17014401
1.5mL centrifuge tubes USA Scientific 1615-5500
15mL conical tube  VWR 89039-668
50mL conical tube VWR 89039-660
Phosphate Buffered Saline (PBS)  Sigma-Aldrich 21-040-CM
Ethanol Fisher Science 04-355-451
Dissection tools
70μm filters BD Falcon 352350
0.25% trypsin Gibco 25200
Kimwipe VWR 82003-820
Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Science 15710
Alkaline Phosphatase kit Sigma-Aldrich 86R
Silver Nitrate Sigma-Aldrich S6506
Sodium Thiosulfate Sigma-Aldrich S7026
Oil Red O Sigma-Aldrich O0625
Isopropanol Sigma-Aldrich 190764
10% Neutral Buffered Formalin Sigma-Aldrich F5554-4L
Whatman filter Grade 1 Sigma-Aldrich Z274852
Tartrate-Resistant Acid Phosphatase kit Sigma-Aldrich 387A
Glutaraldehyde Electron 16220
MEMα Gibco 12571
Fetal Bovine Serum VWR 97068-085
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122
β-glycerol phosphate Sigma-Aldrich G9891
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4544
DMEM High Glucose  Sigma-Aldrich D5796
Rosiglitazone Cayman Chemical 717410
Insulin Sigma-Aldrich I6634
IBMX Sigma-Aldrich I5879
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
RANKL Peprotech 310-01
mCSF Peprotech 315-02
Axio Observer inverter microscope Zeiss

Referências

  1. Friedenstein, A. J., Latzinik, N. W., Grosheva, A. G., Gorskaya, U. F. Marrow microenvironment transfer by heterotopic transplantation of freshly isolated and cultured cells in porous sponges. Exp Hematol. 10 (2), 217-227 (1982).
  2. Chen, T. L. Inhibition of growth and differentiation of osteoprogenitors in mouse bone marrow stromal cell cultures by increased donor age and glucocorticoid treatment. Bone. 35 (1), 83-95 (2004).
  3. Kokabu, S., et al. BMP3 suppresses osteoblast differentiation of bone marrow stromal cells via interaction with Acvr2b. Mol Endocrinol. 26 (1), 87-94 (2012).
  4. Ghali, O., et al. Dexamethasone in osteogenic medium strongly induces adipocyte differentiation of mouse bone marrow stromal cells and increases osteoblast differentiation. BMC Cell Biol. 16, 9 (2015).
  5. Kretlow, J. D., et al. Donor age and cell passage affects differentiation potential of murine bone marrow-derived stem cells. BMC Cell Biol. 9, 60 (2008).
  6. DeMambro, V. E., et al. Igfbp2 Deletion in Ovariectomized Mice Enhances Energy Expenditure but Accelerates Bone Loss. Endocrinology. 156 (11), 4129-4140 (2015).
  7. Maridas, D. E., et al. IGFBP-4 regulates adult skeletal growth in a sex-specific manner. J Endocrinol. 233 (1), 131-144 (2017).
  8. Nadri, S., et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenchymal stem cells. Int J Dev Biol. 51 (8), 723-729 (2007).
  9. Sreejit, P., Dilip, K. B., Verma, R. S. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  10. Abdallah, B. M., et al. CD34 defines an osteoprogenitor cell population in mouse bone marrow stromal cells. Stem Cell Res. 15 (3), 449-458 (2015).
  11. Akiyama, K., et al. Characterization of bone marrow derived mesenchymal stem cells in suspension. Stem Cell Res Ther. 3 (5), 40 (2012).
  12. Lin, C. S., Ning, H., Lin, G., Lue, T. F. Is CD34 truly a negative marker for mesenchymal stromal cells?. Cytotherapy. 14 (10), 1159-1163 (2012).

Play Video

Citar este artigo
Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice. J. Vis. Exp. (131), e56750, doi:10.3791/56750 (2018).

View Video