Этот протокол описывает комбинаторного использования чип seq, 4СУ seq, Общая РНК seq и рибосома профилирование для клеточных линий и главные ячейки. Это позволяет отслеживание изменений в фактор транскрипции привязки, de novo транскрипции, обработки РНК, оборот и перевод с течением времени и отображает общий ход событий в активированных или быстро меняющейся клеток.
После активации, клетки быстро изменить их функциональные программы и, таким образом, их профиль выражения гена. Массовые изменения в экспрессии генов происходят, например, во время клеточной дифференцировки, морфогенез и функциональной стимуляции (например, активации иммунных клеток), или после воздействия наркотиков и других факторов от местной окружающей среды. В зависимости от типа раздражитель и ячеек эти изменения происходят быстро и на любом уровне регуляции генов. Отображение всех молекулярных процессов ответивших ячейки для определенного типа стимул/наркотиков является одним из самых сложных задач в области молекулярной биологии. Здесь мы описываем протокол, который позволяет одновременный анализ нескольких слоев регуляции генов. Мы сравниваем, в частности, транскрипционный фактор привязки (Chromatin иммунопреципитация последовательности (чип seq)), de novo транскрипции (4-thiouridine последовательности (4СУ seq)), обработка мРНК и оборот, а также перевод (рибосомы Профилирование). Объединив эти методы, можно отображать подробные и генома широкий курс действий.
Секвенирование недавно транскрипции РНК особенно рекомендуется при анализе быстро адаптации или изменения систем, поскольку это изображает транскрипционный анализ деятельности всех генов во время воздействия 4СУ (независимо от того, являются ли они вверх – или downregulated). Комбинаторного использования всего РНК seq и рибосома Профилирование позволяет дополнительно расчета темпов оборота и перевод РНК. Bioinformatic анализ результатов высокопроизводительного секвенирования позволяет много средств для анализа и интерпретации данных. Созданных данных также позволяет отслеживать, co-transcriptional и альтернативного сплайсинга, только, чтобы упомянуть несколько возможных результатов.
Комбинированный подход, описанный здесь может применяться для различных модельных организмов или типы клеток, включая клетки первичной. Кроме того мы предоставляем подробные протоколы для каждого используемого метода, включая контроль качества и обсудить потенциальные проблемы и подводные камни.
В последние годы последовательности РНК (РНК seq) стала стандартным инструментом для анализа всех выразил РНК в клетки или организма1. Однако чтобы понять весь процесс адаптации в ответ на конкретный раздражитель/наркотиков клеток, необходимо полностью определить все основные процессы, начиная от мРНК транскрипции для обработки, оборот и перевод. Краткосрочные изменения в транскрипции РНК вряд ли может быть измерена всего RNAseq, поскольку изменения всего РНК зависят от факторов например РНК полураспада и транскрипционный анализ деятельности, которые являются плохой шаблон для отражения адаптацию клеток экологические последствия2,3. Действительно было разработано множество различных новых методов секвенирования, которые позволяют проводить анализ различных шагов в процессе гена регулирование4 при сочетании в правильной манере. Этот протокол описывает как объединить некоторые довольно легко применимые последовательности методы, которые позволяют отслеживания регулирование основных слоев мРНК в сравнительной форме. Для анализа транскрипционный анализ деятельности, были описаны различные методы, такие как Кап анализ гена выражение (Кейдж)5, родной удлинение Стенограмма последовательности (NET-seq)6и геном всей ядерной выбега (GRO-seq)7 , 8, а также bromouridine последовательности (Bru-seq) и 4-thiouridine последовательности (4СУ seq), которые используют метаболитов которые включены в недавно транскрипции РНК9,10, только для того, чтобы упомянуть несколько. Хотя Кейдж идентифицирует сайт старт точные транскрипции, NET-seq и ГРУ seq доставить более точной информации о чтении направления и 4СУ seq (который является метод, описанный здесь) обнаруживает только недавно транскрипции РНК. Однако, 4СУ seq очень чувствительна и может применяться в различных временных рамках для измерения количественных транскрипционный анализ активности в активно меняющихся клеток, а также количественные изменения в обработке мРНК (который и происходит в течение нескольких минут)9, 11,12. Кроме того 4СУ seq идеально сочетать с РНК seq для вычисления РНК текучести для генов9. Транскрипция мРНК осуществляется путем РНК-полимераза II (RNAPII), который в свою очередь зависит от множества факторов, таких, как факторы транскрипции, изменения гистона и общие активаторы/подавляющего, которые могут даже быть частью транскрипционный анализ комплекс. Чтобы проверить, сколько гена/промоутер/усилитель регионы руководствуются одним из факторов, был разработан чип seq, который теперь является стандартным методом для этой цели, благодаря много коммерчески доступных антитела13. Однако хотя ChIPseq дает четкую информацию о где регулирующие факторы bind, он не отражает, если это действительно приводит к изменениям в транскрипции14. Таким образом выполнение чип seq с 4СУ seq является идеальное сочетание для таких биологических вопросов. Регуляцию экспрессии генов также может произойти на более позднем этапе, поскольку уровни mRNA и белка не обязательно коррелирует15,16, указывающее потенциально существенные положения о поступательные или столб-поступательные уровень, в зависимости от контекста. В 2011 году рибосома профилирования были впервые объединены с РНК seq и теперь является методом выбора для количественной оценки изменений, которые происходят быстро белка, так как есть еще некоторые ограничения чувствительности с масс-спектрометрии17. Действительно, тарифы на перевод, полученные из таких методов было показано, чтобы доставить относительно хорошую оценку изменений в уровнях белка (по крайней мере измеряется для долгосрочных изменений) и позволяют еще более подробный взгляд на процесс перевода, например определение начала стороне и альтернативного перевода кадров17. Комбинаторного использования всех четырех методов могут быть использованы в устойчивом состоянии, между различными типами клеток, или в времени серийный эксперимент быстро изменяющейся ячейки11. Это использование предоставляет генома широкий обзор изменений в привязке фактор транскрипции, влияющие на транскрипции РНК, обработка и перевод.
Анализируя весь процесс регуляции генов необходимо полностью понимать клеточной адаптации в ответ на конкретный раздражитель или лечения. Сочетание всего РНК seq, 4СУ seq, рибосома профилирование и чип seq в разное время точках приводит к всесторонний анализ основных процессов регуляции генов с течением времени. Для определения экспериментальной установки, а также оптимальное время точки требуется глубокое понимание биологических процессов.
Поскольку методы для изучения гена регулирование улучшить быстро, эти протоколы могут быть адаптированы к быстрым изменениям. Тем не менее они обеспечивают наиболее важные методы для изучения механизмов регулирования основных генов в любой тип клеток. Здесь мы рассмотрим некоторые из ловушек и факты, которые необходимо учитывать при использовании этих методов.
Клетки: Клетки должны быть весьма жизнеспособной и, если с помощью первичных изолированных клеток, чистоту клеточных популяций должна быть гарантирована (например, анализ СУИМ для первичного Т-клетки). Даже немного подчеркнул клетки могут повлиять на результаты этих методов очень чувствительной последовательности и снизить количество вновь переписаны или переведенный НКА и привести к нежелательных отсчетов реакции стресса в последовательности результатов. Скорость центрифугирования, упомянутых в этом протоколе для пеллет клетки оптимизирован для первичного Т-клеток. Таким образом регулировать скорость в зависимости от типа ячейки.
4 Су эффекты на физиологии клетки: Помимо вышеупомянутых вариантов для проверки минимальной возмущений в клеточной физиологии при добавлении 4СУ могут выполняться дополнительные и/или дополнительного анализа, особенно, когда число клеток ограничены. Влияние на пролиферацию клеток может быть проверена путем проверки время удвоения клеток путем простого подсчета маркировку и непомеченного клетки. Ядрышковые стресс индукции также может быть проверена анализа морфологии клеток через иммунофлюоресценции окрашивание nucleolin и ядер. Для дальнейшей проверки воздействия 4СУ, измененные глобальные ген выражение можно судить по корреляции читать графов с метками всего РНК к немеченому всего РНК.
Мобильных номеров: В пробирке создан Т-клеток мы рекомендуем, начиная с по крайней мере количество клеток, указанных в таблице 2. Выбор надлежащего числа метода в зависимости от типа клеток. Так как Т-клетки имеют меньше цитоплазмой и РНК, по сравнению с другими клетками, скорее нижнюю других ячеек будет адекватной. Для чип seq числа клеток сильно зависит антитела, используемые и уровень экспрессии протеина интереса внутри клетки. Для гистона или RNAPII чип может использоваться ДВ клетки, тогда как число клеток необходимо увеличить при использовании факторов транскрипции, особенно если они выражены при низких уровнях.
4 Су маркировки и РНК biotinylation: При использовании адэрентных клеток, 4СУ маркировки могут быть направлены, как описано в Rädle и др. 19 начиная с клетки очень быстро включать 4СУ, его можно добавить непосредственно в среде подвеска, сторонником или полу адэрентных клеток.
Рекомендуется для запуска biotinylation с 60-80 мкг РНК. Тем не менее, меньше количества РНК могут быть использованы, хотя мы не тест менее чем 30 мкг. Добавить coprecipitant (например, GlycoBlue) при проникающих РНК, если шарик трудно увидеть. Даффи et al. также показали, что methylthiosulfonate активированный биотин (МТС биотин) более эффективно реагирует с надписью 4СУ РНК чем HPDP-биотин31. Следовательно она может быть стоит рассмотреть переход на МТС биотин, в частности, для восстановления малых РНК, которые склонны иметь меньше уридина остатков (см. biotinylation протокол, упомянутые Даффи и др.; см. Очистка 4СУ меченых РНК, Экспериментальные методы).
Для восстановления недавно транскрипции РНК можно использовать парамагнитных бусы или Очистка РНК бусины по вашему выбору. Всегда принимать во внимание, что эти комплекты могут или не могут очистить для конкретных молекул РНК. Например если вы заинтересованы в адаптивной, рассмотрите возможность использования конкретные наборы для захвата Мирна и последовательности.
Количественной оценки недавно транскрипции РНК: Чтобы точно измерить недавно транскрипции РНК, измерение должно выполняться подходящего флуориметр (см. Таблицу материалы). В течение 1 ч 4СУ воздействия недавно транскрипции РНК представляет около 1-4% всего РНК. Недавно транскрипции РНК 1 ч помечены, активированные Т-клетки состоит из ~ 90-94% рРНК11.
Рибосомы профилирование: При создании метода, мы определили, что использование 1.5 x количество нуклеиназы, чем предлагается в исходный протокол гарантирует правильное пищеварение. Кроме того побочные эффекты не сообщалось на повышенных количествах нуклеиназы. Так как это довольно трудно overdigest РППБ, хотя они являются частью РНК, обязательность рибосомных белки, можно еще немного увеличить объем к Титруйте оптимального нуклеиназы пищеварение.
Если меньше, чем 500 нг ПФР РНК были восстановлены в шаге 4.4.2, повторяю, рРНК истощения и бассейн очищается РППБ с РНК Clean & концентратор-5 столбцов. Кроме того Загрузите два идентичных образцов рядом друг с другом на геле (шаг 4.5.3) и бассейн гель фрагментов во время элюции РНК от геля (шаг 4.5.6).
Мы рекомендуем, резка РППБ на геле максимально плотно групп nt 28 и 30. Это помогает в устранении ненужных фрагментов с теорией и tRNAs, которая позже станет частью вашей библиотеки и уменьшить считывает последовательность для вашего РППБ.
Также рекомендуется избегать УФ света во время очищения геля. Это может создать Ники в РНК фрагменты, а также пиримидина димеры, которые в конечном итоге может серьезно повлиять на Библиотека подготовки и последовательности результатов.
Библиотека подготовка и последовательности данных: Рибосомы, профилирование протокол позволяет создать библиотеку cDNA, подходящих для виртуализации. Образцы, порожденных 4СУ маркировки может использоваться для приготовления библиотека с любой соответствующий комплект последовательности РНК. После недавно транскрипции РНК особенно при использовании коротких маркировки раз, может быть еще не polyadenylated, не поли-выбор должны выполняться. Вместо этого, мы настоятельно рекомендуем рРНК истощения, чтобы предотвратить уменьшение глубины последовательности для действительного образца. С помощью Т-клеток, мы начали с 400 нг вновь переписаны и общая РНК (в зависимости от комплекта, см. материалы), выполненных рРНК истощения и сокращение циклов для амплификации PCR для сведения к минимуму предвзятость ПЦР. Подготовка библиотеки могут быть выполнены с меньше исходного материала. Для учета библиотеки сложности количество циклов PCR должны быть оптимизированы.
Для чип seq также имеются многочисленные наборы для приготовления библиотеки. В нашей библиотеке руки подготовка работал хорошо, начиная с 2 нг чип ДНК (см. материалы для предложение на какой комплект для использования). Не забудьте проверить индексы для цветовой баланс во время виртуализации. Мы рекомендуем последовательности глубины ≥40 х 106 читает каждый 4СУ seq, всего РНК seq, и чип seq образцы и ≥80 x 106 гласит на рибосомы, профилирование образцы. Секвенирование глубина зависит выборки и анализа течению биоинформатики и следует тщательно рассмотреть. Для анализа intronic читает для cotranscriptional сращивания, 100 bp в паре конец последовательности должен быть выбран.
Последовательности предвзятости: Секвенирование стал золотым стандартом при определении глобальных изменений в транскрипции, перевод или связывания фактор транскрипции. В последние годы существующие методы были толкнул до предела или новые методы были разработаны для виртуализации все больше начиная небольшое РНК. Это требует амплификация cDNA, который вводит шум или уклон. Недавно уникальные идентификаторы молекулярные (UMIs) были разработаны для экспериментально определить дубликаты, представленный ПЦР. Недавно было показано, что UMIs просто слегка улучшить последовательность мощности и уровень ложных обнаружения для дифференциальной ген выражение32. Тем не менее рекомендуется использовать уникальные идентификаторы молекулярные (UMIs) для всех библиотек виртуализации для управления для библиотеки сложности, особенно когда начиная с низкого количества РНК и когда требуется много циклов PCR.
Буфер и фондовых решения: Все буферы 4СУ seq и рибосома профилирования должна быть подготовлена в строгих условиях, RNase бесплатно, с использованием воды, свободной от нуклеиназы. Мы рекомендуем вам купить готовые бесплатные нуклеиназы NaCl, трис-HCl, ЭДТА, цитрат натрия и воды. Для обеспечения свободной от нуклеиназы условий, RNase Обеззараживание решение может использоваться для очистки пипетки или поверхностей. Все буферы для чип seq необходимо быть по меньшей мере DNase бесплатно и может храниться при комнатной температуре. Всегда добавить ингибиторы протеазы и, при необходимости, битор фосфатазы прямо перед использованием и держите на льду.
Биоинформатика: Анализ всех данных последовательности (то есть, чип seq, РНК seq и ribsosome профилирования) включает в себя контроль качества (например, с помощью FastQC, http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/), обрезки адаптер (например, с 20cutadapt) следуют картирования генома ссылка для клетки под исследование. РНК seq данных (как общей, так и 4СУ seq), а также рибосомы, Профилирование данных требуется сращивания РНК seq mapper, например ContextMap 221. Для выравнивания данных unspliced чип seq используя АДЖ-MEM22 является достаточным. Экспрессии генов могут быть рассчитаны с помощью модели (читает за Kilobase экзона за миллион сопоставить фрагменты) RPKM1, после определения читать сиг / Джин с помощью программы, например featureCounts23. Для вызова пик от чип seq данных, доступны ряд программ, например, MACS24 или25GEM. Далее вниз по течению анализы могут быть выполнены в R26, в частности с помощью инструментов, предоставляемых Bioconductor проекта27.
Одной из основных задач в деле интеграции 4СУ – и всего уровнем РНК и переводческая деятельность от рибосома профилирование вот нормализации. Классический подход к решению этой проблемы является нормализация уровня домоустройства генов. Чтобы уменьшить шум из-за случайных колебаний для отдельных генов домоустройства, рекомендуется не только использовать несколько домоустройства генов, но средний уровень для более широкого набора, например > 3000 домоустройства генов, составленный Айзенберг и Леванон28 . Для расчета показателей текучести РНК от соотношения 4СУ-до всего РНК, нормализации основан на средний оборот ставки (например, предполагая РНК полураспада 5 h)29. Однако поскольку это предполагает не общего изменения для домоустройства генов, мы рекомендуем использовать анализ подходов зависит от нормализации, например, кластеризацию рядов различных типов данных для выявления групп генов на основе корреляции с различных поведение в транскрипции и трансляции во время активации. Подробное описание по интеграции биоинформатический различных типов данных мы ссылаемся на оригинальной публикации11.
Анализ интеграции данных и темпы оборота: Недавно опубликованный документ33 , сравнивая полураспада определяется элемент управления мультиплексированных гена (MGC) глобальные методы можно показать, что полураспада коррелирует с полученными метаболических обозначая методами, по сравнению с другими методами (например, лучшее Общие ингибирование транскрипции наркотиков). Однако следует отметить, что различия между half-life расчеты могут возникнуть и были описаны в 15,34. Мы составляют большую часть проблемы и разногласия, которые появились в ответ стресса из-за длительного 4СУ воздействия. Таким образом необходимо исключить стресс ответ, представленный 4СУ маркировки. Для дополнительной проверки текучесть, мы рекомендуем использовать mgc.
Кроме того набор данных, созданный здесь также могут использоваться для более комплексных данных анализа (например, регулирование длиной некодирующих RNAs)35,36.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Ларса Dölken за советы установить 4СУ маркировки для первичного Т-клеток; Элизабет Graf и Томас Schwarzmayr для критических помощь в библиотеке поколений и последовательности; Дирк Eick и Эндрю Флетли за предоставление RNAPII и Т-клеток антител; N. Генриетта Uhlenhaut и Franziska Greulich за помощь в подготовке библиотека для чип seq; Кэролайн C. Фриделя было поддержано грантов FR2938/7-1 и CRC 1123 (Z2) от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG); Elke Гласмахер было поддержано Грант GL 870/1-1 из Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) и немецкий центр для исследования мочеизнурения (DZD), Гельмгольца Zentrum München.
4sU-labeling | |||
4-thiouridine (100 mg) | Carbosynth | 13957-31-8 | Prepare 50 mM stock in sterile H2O/PBS; store at –20°C in aliquots of 50-500 µl; do not refreeze. |
1.5 ml safe-lock tubes | Eppendorf | 30121589 | Optional |
1.5 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72692005 | Compatible with Dimethylformamide |
15 ml tubes | BD Falcon | 352096 | Compatible with Dimethylformamide |
2.0 ml screw-top polypropylene tubes | Sarstedt | 72694005 | Compatible with Dimethylformamide |
50 ml tubes | BD Falcon | 352070 | Compatible with Dimethylformamide |
Agencourt RNAClean XP | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
Chloroform | Sigma Aldirch | 372978 | WARNING – HAZARDOUS TO HEALTH |
Dimethylformamide | Sigma Aldrich | D4551 | |
Dithiothreitol (DTT) | Roth | 6908.1 | Prepare as 100 mM DTT in nuclease-free H2O; always prepare fresh |
Ethanol | Merck | 1.00983.1000 | |
EZ-Link Biotin-HPDP (50 mg) | Pierce | 21341 | Prepare 1 mg/ml stock solution by dissolving 50 mg Biotin-HPDP in 50 ml DMF. Gentle warming enhances solubilisation. Store at 4°C in aliquots of 1 ml. DMF dissolves some plastic materials. We recommend to use glass pipettes to transfer DMF from ist stock glass bottle to 50 ml Falcon tubes. |
High Sensitivity DNA Kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
Isopropanol | Merck | 1.09634.1011 | |
NaCl (5M) | Sigma Aldrich | 71386 | Stock solution |
nuclease-free EDTA (500 mM ), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | Stock solution |
Nuclease-free H2O | Sigma Aldrich | W4502 | Stock solution |
nuclease-free Tris Cl (1M), pH 7.4 | Lonza | 51237 | Stock solution |
Phase Lock Gel Heavy tubes (2.0 ml) | 5Prime | 2302830 | Use in step 1.3.4. |
Polypropylene 15 ml centrifuge tubes | Greiner Bio-One | 188271 | Or equivalent; they have to tolerate up to 15,000 × g |
QIAzol Lysis Reagent (200 ml) | Qiagen | 79306 | Use this or equivalent TRI reagent for RNA isolation, WARNING – CORROSIVE and HAZARDOUS TO HEALTH! Ensure immediate access to Phenol antidote (PEG-Methanol) |
Qubit RNA HS assay kit | Life Technologies | Q32852 | Use this kit for quantifying RNA quantity in step 1.4.11 |
RNeasy MinElute Kit | Qiagen | 74204 | Optional; includes Buffer RLT |
Sodium citrat | Sigma Aldrich | C8532 | Prepare 1.6 M stock solution using nuclease-free water |
Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
µMacs Streptavidin Kit | Miltenyi | 130-074-101 | Store at 4°C, includes µMacs columns used in step 1.4.6. (store at RT) |
Cell viability and stress assay | |||
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences | 559763 | Optional |
Thapsigargin | Sigma-Aldrich | T9033 | Optional |
p53 | abcam | ab26 | Optional |
p-EIF2a (Ser51) | Cell Signaling | 9721 | Optional |
BH3I-1 | Sigma-Aldrich | B 8809 | Optional |
Buffers | |||
4sU Washing Buffer | store at RT | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.1% Tween 20 in nuclease-free H2O | |
Biotinylation Buffer (10x) | store at 4 °C | 100 mM Tris pH 7.4, 10 mM EDTA in nuclease-free water; make aliquots of 1 ml; store at 4°C | |
RNA precipitation buffer | store at RT | 1.2 M NaCl, 0.8 M sodium citrate in nuclease free water. Prepare in advance under nuclease-free conditions. Store at room temperature in 50 ml falcon tubes. | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | |
RNA 6000 Nano Kit | Agilent | 5067-1511 | Use this kit to verify RNA integrity in step 1.3.10 |
RNA 6000 Pico Kit | Agilent | 5067-1513 | Optional |
UV/VIS spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 1000 | Or equivalent. Use in step 1.2.2/3.1.8/3.3.3/3.4.3 |
High-speed centrifuge | Thermo Scientific | Heraeus Multifuge X3R | Or equivalent equipment capable of reaching 13,000 × g |
High-speed rotor | Thermo Scientific | Fiberlite F15-6 x 100y | |
Adaptors for 15 ml tubes | |||
Refrigerated table-top centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Or equivalent. |
Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer C | Or equivalent. |
Magnetic stand | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | One stand holds 8 µMacs columns. |
Ultra-fine scale | Mettler Toledo | ML204T | Or equivalent. |
E-Gel iBase Power System | Invitrogen | G6400UK | For RNA gels; or equivalent. |
E-Gel EX 1% agarose precast gels | Invitrogen | G4020-01 | For RNA gels; or equivalent. |
DynaMag-2 Magnet-1 each | Life Technologies | 12321D | |
RNaseZap | Sigma | R2020 | Optional |
TruSeq stranded total RNA library prep kit | Illumina | RS-122-2201 | Or equivalent. For T cells we used 400 ng 4sU and Total RNA with 11 cycles for PCR amplification. rRNA depletion is included in this kit |
Nanodrop | Thermo Scientific | use a Nanodrop or equivalent instrument to measure RNA concentration | |
Ribosome Profiling | |||
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPYSC12116 (Yeast) | |
TruSeq Ribo Profile kit (Mammalian or Yeast) | Illumina | RPHMR12126 (Mammalian) | |
Illustra MicroSpin S-400 HR Columns | GE Healthcare | 27-5140-01 | |
RNA Clean & Concentrator-25 kit | Zymo Research | R1017 | |
RNA Clean & Concentrator-5 kit | Zymo Research | R1015 | |
Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Human/Mouse/Rat) | Illumina | MRZG126 or MRZG12324 | |
(High Sensitivity DNA Kit) | Agilent Technologies | 5067-4626 | Already needed for 4sU-seq |
All other consumables and equipment are listed in the User guide | !!! | Carefully read the user guide and order required consumables in advance (consider a long delivery time for some consumables e.g. gels) | |
ChIP | |||
10 mM Tris-HCl (pH 8.0) | gereral lab supplier | ||
100 bp Plus Marker | Thermo Fisher | SM0323 | |
16 % Formaldehyde | Thermo Fisher | 28908 | Add to a final concentration of 1 % |
70% EtOH | gereral lab supplier | Always prepare fresh | |
Agarose | gereral lab supplier | ||
Agencourt RNAClean XP beads | Beckman Coulter | A63987 | We recommend to use these paramagnetic beads. Aliquot and store at 4°C |
ChIP library preparation kit | KapaBiosystems | KK8504 | Or use the kit of your choice |
DNA low bind microcentrifuge tubes | Eppendorf | Z666548-250EA | or equivalent |
Dynabeads Protein G | Invitrogen | 10004D | Use these superparamagnetic beads coupled to protein G in step 4.3.1.; Bring to RT before use |
Glycine | gereral lab supplier | Prepare a 2M stock solution | |
Glycogen | Roche | 10-901-393-001 | |
MinElute PCR Purification Kit | Qiagen | 28004 | Use this kit (or equivalent) to purify chromatin in step 4.2.4. |
Phosphatase Inhibitor (PhosStop) | Roche | 4906837001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Power SYBRgreen Master mix | Thermo Fisher | 4367659 | |
Protease Inhibitor (cOmplete, EDTA-free) | Roche | 11873580001 | Add freshly to the buffer and keep on ice |
Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | |
Qubit dsDNA HS Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Use this kit for quantifying DNA quantity in step 4.6.4. on a Qubit Fluorometer |
Rnase, DNase free | Roche | 11-119915001 | |
Salmon sperm (sonicated to around 100bp) | Sigma | D1626 | |
TE pH 8.0 | gereral lab supplier | ||
Antibodies (ChIP grade if possible) | |||
anti-RNA Pol II [8WG16] | abcam | ab817 | |
anti-Histon H3K36me3 | abcam | ab9050 | |
or antibody of interest | |||
Buffers | |||
Binding/Blocking buffer | Store at RT | PBS with 0.5 % BSA and 0.5 % Tween 20 | |
Cell-Lysis buffer | Store at RT | 5 mM Pipes [pH 8.0], 85 mM KCl, and 0.5 % NP40 | |
ChIP IP buffer | Store at RT | 0.01 % SDS; 1. 1% Triton X-100;1.2 mM EDTA; 16.7 mM Tris-HCl, pH 8.1; 16.7 mM NaCl | |
Elution buffer | Store at RT up to 6 months | 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM EDTA (pH 8.0), 300 mM NaCl and 0.5 % SDS | |
Nuclei-Lysis buffer | Store at RT | 50 mM Tris [pH 8.0], 10 mM EDTA, and 1 % SDS | |
Wash buffer I | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20mM Tris-HCL pH 8.1; 150 mM NaCl | |
Wash buffer II | Store at RT | 0.1 % SDS; 1 % Triton X-100; 2 mM EDTA; 20 mM Tris-HCL pH 8.1; 500 mM NaCl | |
Wash buffer III | Store at RT | 0.25 M LiCl; 1% NP-40; 1 mM EDTA; 10 mM Tris-HCl, pH 8.1 | |
Equipment | |||
2100 Bioanalyzer instrument | Agilent | G2939BA | use this instrument for electrophoretical analysis |
Nanodrop | Thermo Scientific | ||
Bioruptor TBX microtubes 1.5 ml | Diagenode | C30010010 | |
or tubes special for your sonication device | |||
Bioruptor sonication device or sonication device of your choice | Sonication of T cells with Bioruptor: 20 – 25 cycles (30 s on, 30 s off at high in two 1.5 ml bioruptor microtubes with 500 µl each tube) | ||
Magnetic stand for tubes | |||
Thermomixer | |||
Agarose gel electrophoresis | |||
Qubit Fluorometer | Thermo Scientific | Use this Fluorometer for quantifying low amounts of RNA/DNA |