成年小鼠背根节外植体和分离细胞模型调查可塑性和对包括病毒感染在内的环境侮辱的反应
Summary
在本报告中, 强调了脊髓培养和分离的原代培养的小鼠背根神经节的优势, 以调查与神经元-胶质细胞相互作用的广泛机制, 可塑性,neuroinflammation 和对病毒感染的反应。
Abstract
本协议描述了鼠源性背根神经节 外植体的原生模型, 并介绍了分离的感官神经元和胶质细胞的与后向的联合培养。这些都是有用的和多才多艺的模型, 以调查各种生物学反应的生理和病理条件的周围神经系统 (三七), 从神经胶质相互作用, 可塑性,neuroinflammation 和病毒感染。与单纯的单细胞模型相比, 根背节外植体的使用具有很科学的优越性。例如, 作为一种脊髓的文化, 根背节外植体允许在整个神经元网络中进行 “前体” 转移, 包括在所有神经元和胶质功能中发挥重要作用的胞内微环境。此外, 在几天内还可以保持根背根节外植体, 并且培养条件可能会因需要而受到扰动. 此外, 收获的根背根可以进一步分离成一个体外的原始感觉神经元和卫星胶质细胞的共培养, 以研究神经元-胶质相互作用, neuritogenesis, 轴突锥相互作用与胞外微环境, 更一般, 与神经元代谢相关的任何方面。因此, 背节-外植体系统提供了极大的灵活性, 以成本效益的方式研究与生物、生理和病理条件有关的广泛事件。
Introduction
在这篇手稿中, 我们报告了一个方法, 以获得一个脊髓的前体模型的小鼠神经根神经节模型系统作为一种保存的组织样的微环境, 以调查广泛的生物学反应, 从神经胶质的污辱范围相互作用, 可塑性, 炎症标志物, 病毒感染。此外, 我们进一步制定了一个协议, 以建立一个主要的共同文化的根神经节衍生的单一感官神经元和卫星细胞。
根背节是位于中枢神经系统外的卫星灰色物质单元, 沿脊髓神经的脊柱脊髓根部。神经节, 位于椎间孔附近, pseudounipolar 的感觉神经元和卫星胶质细胞。pseudounipolar 神经元的特点是一个单一的突起, 它分裂成一个外围过程, 将躯体和内脏的输入从外围目标带到细胞体, 以及将感官信息从细胞体提交中枢神经系统的中心过程。结缔组织胶囊定义并分离出中枢神经系统的神经元和胶质细胞的外围簇。无产后细胞迁移到或从根背根曾经被描述和一个地方干细胞利基负责的神经性事件发生在整个生命中1。因此, 这个模型特别适合研究成人神经发生, axonogenesis, 创伤性病变的反应, 细胞死亡2,3,4,5,6,7 ,8,9 。
在 neuroregeneration 领域中, 从体内和说明体外中收获的根神经节重现 axonotmesis, 这是一种损伤状态, 其中轴突完全切断, 神经元细胞体与支配目标10 分离。 ,11。众所周知, 周围神经损伤会导致节根节内的基因表达减少和增加, 许多这些变化是再生过程的结果, 但许多可能也是由于免疫应答或来自非神经细胞的另一种反应。通过使用一个孤立的根神经节的前体系统, 这些复杂性被删除, 机械通路可以更容易地调查。
除了它在向中枢神经系统传递感官输入的中心作用外, 许多神经递质的受体丰富, 包括 GABA12,13,14,15在神经元躯体的水平以及神经元间交叉激励的证据可能表明, 根背根是成熟的感官输入的初步集成商 16, 17.这些新发现给根背节外植体提供了类似于其他 “微型脑” 模型的微型神经元网络系统的特性, 这是神经组织特异的 organoids 用于更广泛的实验领域的调查和治疗神经疾病的方法18,19。这些证据连同根背根是一个离散和明确定义的神经组织簇包围的结缔组织胶囊, 使它成为一个合适的器官为前体移植。
培养小鼠背根是一种有吸引力的多细胞选择模型的人 pathophysiologies 由于结构和遗传相似的物种之间。此外, 一个大的转基因小鼠菌株储存库, 是非常有利于未来的机械研究。突起延长在开发期间和在损伤以后需要机械相互作用在成长锥体和基体之间20,21。纳米和微阵列基材已被用作工具, 以指导突起的产物, 并表明他们的能力, 以响应地形特征在他们的微环境。神经元已经被证明可以生存, 坚持, 迁移, 并定向他们的轴突, 以导航表面特征, 如凹槽在基板22,23。然而, 这些研究通常利用培养的细胞系, 很难预测主要神经细胞将如何响应明确定义的, 物理提示在体内或前体。
本建议使用的小鼠背根的前体外植体模型模拟了生长轴突周围的真实细胞细胞相互作用和生物化学线索。在许多不同的实验范式, 从轴突再生, 干细胞生产, 到 neuroinflammation, 根背根外植体模型继续作为一个宝贵的工具来调查病毒感染和潜伏期方面的感官神经节24,25,26,27。
神经系统 (NS) 一般是病毒感染的目标28,29,30。大多数病毒感染上皮和内皮细胞表面, 并通过周围神经感觉和运动纤维从表面组织到 NS 的途径。特别是, 在上皮细胞最初感染后, 单纯疱疹病毒1型 (HSV-1) 在感觉神经节中建立终生潜伏期, 最好是31,32的背根。HSV-1 neuroptropic 的感染的能力最终导致神经系统疾病的33。
Protocol
Representative Results
Discussion
前体背节模型对于研究各种事件 (如神经元-胶质细胞相互作用) 以及微环境对神经元和胶质代谢的影响 (37) 极为有用。此外, 根背节模型可作为一种成本效益高的工具, 通过开发前体内系统进行急性慢性和潜伏感染阶段或某种疾病, 以此解决有关致病机制和相关标记的相关问题。此外, 在根背节外植体中的小分子筛查库可以利用这种植块模型进行药物开发。体外…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们衷心感谢中西部大学的影像核心设施 (MWU) 和学生组 [Chanmoly、克里斯托弗 Dipollina、达里尔 Giambalvo 和凯西 Sigerson] 在细胞培养和成像工作中的贡献。这项研究工作得到了 MWU 的内部拨款资助, 用于中频和研究开办基金 V.T。
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
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