Volwassen muis DRG Explant en losgekoppeld van cel modellen om te onderzoeken Neuroplasticiteit en reacties op milieu beledigingen, met inbegrip van de virale infectie
Summary
In dit verslag zijn de voordelen van organotypic culturen en gedissocieerde primaire culturen van muis-afgeleide dorsal root ganglia gemarkeerd om te onderzoeken van een breed scala van mechanismen die zijn gekoppeld aan neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, neuroinflammation, en reactie op virale infectie.
Abstract
Dit protocol beschrijft een ex vivo -model van de muis afkomstige dorsal root ganglia (DRG) explant en in vitro DRG afkomstige co cultuur van gedissocieerde sensorische zenuwcellen en gliacellen satelliet. Dit zijn handige en veelzijdige modellen te onderzoeken van een verscheidenheid van biologische reacties fysiologische en pathologische omstandigheden van het perifere zenuwstelsel (PNS) variërend van neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, gekoppeld neuroinflammation en virale infectie. Het gebruik van de DRG explant is wetenschappelijk voordelig in vergelijking met simplistische afzonderlijke cellen modellen om meerdere redenen. Bijvoorbeeld, als een organotypic cultuur kunt de DRG explant ex vivo overdracht van een gehele neuronale netwerk, met inbegrip van de extracellulaire communicatie die een belangrijke rol in alle functies voor de neuronale en gliale. Verder, DRG explantaten kunnen ook worden gehandhaafd ex vivo voor enkele dagen en de kweekomstandigheden kunnen worden verstoord als gewenst. Bovendien, kan de geoogste DRG in een in vitro co cultuur van primaire sensorische zenuwcellen en gliacellen satelliet te onderzoeken neuronale-gliale interactie, neuritogenesis, axonale kegel interactie met de extracellulaire verder worden losgekoppeld communicatie, en meer in het algemeen, de diverse aspecten die zijn gekoppeld aan de neuronale metabolisme. Dus biedt het systeem van de DRG-explant een grote mate van flexibiliteit te bestuderen van een breed scala aan gebeurtenissen met betrekking tot de biologische, fysiologische en pathologische omstandigheden op een kosteneffectieve manier.
Introduction
In dit manuscript rapporteren we een methode voor het verkrijgen van een organotypic ex vivo model van een muis afgeleid DRG modelsysteem als een bewaarde weefsel-achtige communicatie te onderzoeken van een breed scala aan biologische reacties op PNS beledigingen variërend van neuron-gliale interactie, Neuroplasticiteit, inflammatoire merkers, virale infectie. Daarnaast ontwikkelden we verder een protocol wilt maken van een primaire co cultuur van DRG-afgeleide één sensorische neuronen en satelliet cellen.
De DRG zijn grijs-zaak-eenheden van de satelliet langs de dorsale wervelkolom wortels van spinale zenuwen buiten het centrale zenuwstelsel (CNS) gelegen. De Deutsche Reichsbahn, gelegen in de nabijheid van lat. foramen, huis pseudounipolar sensorische neuronen en satelliet gliacellen. De pseudounipolar neuronen zijn voorzien van een enkele neurite die splitst in een perifere proces uitvoeren van somatische en viscerale ingangen van perifere doelstellingen aan de cel lichaam, en een centrale proces waarmee sensorische informatie van de cel lichaam in het centraal zenuwstelsel. Een bindweefsel capsule definieert en isoleert van deze perifere cluster van zenuwcellen en gliacellen van de CNS. Geen postnatale cel migratie naar of van de DRG ooit is beschreven en een lokale stamcel niche is verantwoordelijk voor neurogene gebeurtenissen in de gehele leven1. Dus, dit model is bijzonder geschikt om te studeren volwassen neurogenesis, axonogenesis, reageren op traumatische laesie, en cel dood2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Op het gebied van neuroregeneration, de DRG geoogst van in vivo en reproduceert transplanteren in vitro axonotmesis, een voorwaarde van de schade in welke axonen zijn volledig verbroken en de neuronale cel lichaam wordt losgekoppeld van het bezenuwde doel10 ,11. Het is algemeen bekend dat perifere zenuw letsel leiden verminderde en verhoogde genexpressie in de DRG tot kan en veel van deze veranderingen het gevolg van regeneratieve processen zijn maar velen kunnen ook een resultaat van immune reactie of een andere reactie van de non-neuronale cellen. Met behulp van een ex vivo systeem van geïsoleerde DRG, sommige van deze complexiteit is verwijderd en mechanistische trajecten kunnen gemakkelijker worden onderzocht.
Naast haar centrale rol bij het overbrengen van sensorische input voor de CNS, de overvloed van receptoren voor vele neurotransmitters, met inbegrip van GABA12,13,14,15 op het niveau van de neuronale soma, evenals bewijs van interneuronal cross-excitatie kan suggereren dat DRG zijn geavanceerde voorlopige integrators van sensorische input16,17. Deze nieuwe bevindingen verlenen naar de DRG explant de kenmerken van een mini-neuronale netwerksysteem vergelijkbaar met andere “mini brein” modellen, die nerveus-weefsel-specifieke organoids gebruikt voor bredere proefvelden van onderzoek en therapeutische benadering van neurologische ziekten18,19. Deze bewijzen samen met het feit dat de DRG een discrete en welomschreven cluster van neuronale weefsel daaromheen een bindweefsel capsule is, maken het een geschikt orgaan voor transplantatie- ex vivo .
Kweken muis DRG presenteert een aantrekkelijk meercellige optie model van menselijke pathophysiologies als gevolg van structurele en genetische gelijkenissen tussen de soorten. Een grote opslagplaats van transgene muis stammen is bovendien zeer bevorderlijk voor toekomstige mechanistische studies. Neurite uitbreiding zowel tijdens de ontwikkeling en na blessure vereist mechanische interacties tussen groei kegel en substraat20,–21. Nano – en micro-patroon substraten zijn gebruikt als instrumenten om direct uitvloeisel van de neurite en hun capaciteit om te reageren op topografische kenmerken in hun microenvironments aan te tonen. Neuronen hebben aangetoond dat overleven, houden, migreren en hun axonen ga oppervlaktekenmerken zoals groeven in substraten22,23te oriënteren. Echter, deze studies hebben typisch gekweekte cellijnen gebruikt en het is moeilijk te voorspellen hoe de primaire neuronale cellen zal reageren op welomschreven, fysieke signalen in vivo of ex vivo.
De ex vivo explant model van muis DRG gebruikt voor dit voorstel bootst de echte cel-cel interactie en biochemische signalen rond groeiende axonen. Van de vele verschillende experimentele paradigma’s variërend van axonale regeneratie, neurosphere productie, tot neuroinflammation, de DRG explant blijft model om te dienen als een waardevol instrument te onderzoeken van de virale infectie en latentie aspect binnen sensorische ganglia24,25,26,27.
Het zenuwstelsel (NS) is in het algemeen doel voor virale infecties28,29,30. De meeste virussen infecteren epitheliale en endothelial cel oppervlakken en maken hun weg uit de oppervlakte weefsel aan de NS via perifere zenuwen sensorische en motorische vezels. In het bijzonder het herpes simplexvirus type 1 (HSV-1) na een eerste infectie in epitheliale cellen een levenslang latentie bij voorkeur in de sensorische ganglia vestigt de DRG de PNS31,32. HSV-1 neuroptropic vermogen van het infecteren van de PNS leidt uiteindelijk tot neurologische ziekten33.
Protocol
Representative Results
Discussion
De ex vivo DRG model is uiterst nuttig om te onderzoeken van een breed scala aan evenementen zoals neuron-glia interactie en het effect van de communicatie op beide neuronale en gliale metabolisme37. Verder, de DRG-model kan worden gebruikt als een rendabele tool inspelen op relevante vragen betreffende pathogeen mechanisme en bijbehorende markeringen door het ontwikkelen van ex vivo systemen voor chronische en latente acute fase van infectie of in een bepaalde ziekte. Bovendien,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de Imaging core-faciliteit in het Midwesten Universiteit (MWU) en de groep studenten [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo en Casey Sigerson] voor hun bijdragen in celkweek en imaging werk. Dit onderzoekswerk werd gesteund door de de MWU Intramural subsidiefinanciering M.F. en onderzoek start-up fondsen aan V.T.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
Referências
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neurociência. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neurociência. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neurociência. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A., McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Whitley, R., Kimberlin, . D. W., Prober, C. G., Arvin, A., et al. . Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
