Erwachsenen Maus DRG Explant und distanzierte Zellmodelle um Neuroplastizität und Antworten auf ökologische Beleidigungen einschließlich Virusinfektion zu untersuchen
Summary
In diesem Bericht werden die Vorteile des organotypischen Kulturen und dissoziierten Primärkulturen von Maus-abgeleitete Dorsal Root Ganglien hervorgehoben, um eine Vielzahl von Mechanismen, die Neuron-Glia-Interaktion, Neuroplastizität zugeordnet zu nehmen, Neuroinflammation und Antwort auf virale Infektion.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt eine ex Vivo Modell Maus abgeleitet Dorsal Root Ganglien (DRG) Explant und in-vitro- DRG-abgeleitete Co Kultur der dissoziierten sensorischen Neuronen und Gliazellen Satelliten. Dies sind nützliche und vielseitige Modelle, eine Vielzahl von biologischen Reaktionen im Zusammenhang mit physiologischen und pathologischen Bedingungen des peripheren Nervensystems (PNS) von Neuron-Glia-Interaktion, Neuroplastizität bis hin zu untersuchen, Neuroinflammation und Virusinfektion. Die Nutzung der DRG Explant ist wissenschaftlich vorteilhaft im Vergleich zu simpel Einzelzellen Modellen aus mehreren Gründen. Beispielsweise als eine organotypischen Kultur ermöglicht die DRG Explant ex Vivo Übertragung von ein ganzes neuronalen Netzwerk einschließlich der extrazellulären Mikroumgebung, die eine wichtige Rolle in der neuronalen und glialen-Funktionen. DRG-Explantaten können darüber hinaus auch beibehalten werden, ex Vivo für mehrere Tage und die Kulturbedingungen als gestört werden können die gewünschte. Darüber hinaus kann die geerntete DRG weiter in eine in-vitro- Co Kultur der primären sensorischen Neuronen und Glia Satellitenzellen untersuchen neuronale Glia Interaktion, Neuritogenesis, axonalen Kegel Interaktion mit der extrazellulären getrennt werden Mikroumgebung, und allgemeiner, jeden Aspekt der neuronalen Stoffwechsel zugeordnet. Daher bietet das DRG-Explant System ein hohes Maß an Flexibilität, eine Vielzahl von Veranstaltungen im Zusammenhang mit biologischen, physiologischen und pathologischen Bedingungen in einer kosteneffektiven Weise zu studieren.
Introduction
In diesem Manuskript berichten wir über eine Methode, um ein organotypischen Ex Vivo Modell der DRG Modellsystem Maus abgeleitet als eine erhaltene Gewebe-wie Mikroumgebung zu untersuchen, eine Vielzahl von biologischen Reaktionen auf PNS Beleidigungen von Neuron-Glia bis hin zu erhalten Interaktion, Neuroplastizität, Entzündungsmarker, Virusinfektion. Darüber hinaus haben wir ein Protokoll, um eine primäre Co DRG-abgeleitete einzelnen sensorischen Neuronen und Satellitenzellen Evaluierungskultur weiter entwickelt.
Die DRG sind Sat-grau-Materie-Einheiten außerhalb des zentralen Nervensystems (ZNS) entlang der dorsalen Wirbelsäulen Wurzeln der Spinalnerven. Die DRG, befindet sich in der Nähe der Bandscheiben Foramina, Haus pseudounipolar sensorischen Neuronen und Gliazellen Satelliten. Die pseudounipolar Neuronen verfügen über eine einzelne Neuriten, die teilt sich in einen peripheren Prozess mit somatischen und viszeralen Eingänge von peripheren Zielen zum Zellkörper und ein zentrales Verfahren, das sensorischen Informationen vom Zellkörper in das ZNS übermittelt. Eine verbindende Kapsel definiert und isoliert dieser peripheren Cluster von Neuronen und Gliazellen aus CNS. Keine postnatale Zellwanderung zur oder von der DRG hat jemals beschrieben und eine lokale Stammzellnische ist verantwortlich für neurogene Ereignisse im gesamten Leben1. Daher eignet sich dieses Modell besonders zu studieren adulten Neurogenese, Axonogenesis, Reaktion auf traumatische Läsion und Zelle Tod2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Auf dem Gebiet der Neuroregeneration der DRG von in Vivo geerntet und explantierten in Vitro reproduziert Axonotmesis, ein Verletzung Zustand in die Axone vollständig durchtrennt werden und die neuronale Zellkörper ist getrennt vom innervierten Ziel10 ,11. Es ist bekannt, dass periphere Nervenverletzung kann verringerte und erhöhte Genexpression in der DRG verursachen und viele dieser Veränderungen ein Ergebnis der regenerativen Prozesse sind aber viele möglicherweise auch eine Folge der Immunantwort oder eine andere Antwort von nicht-neuronalen Zellen. Mithilfe einer ex Vivo System der isolierten DRG, etwas von dieser Komplexität wird entfernt und mechanistische Wege leichter untersucht werden können.
Neben ihrer zentralen Rolle bei der Vermittlung der Sinneseindrücke, des ZNS, die Fülle der Rezeptoren für viele Neurotransmitter GABA12,13,14,15 auf der Ebene der neuronalen Soma einschließlich sowie Nachweis der interneuronale Kreuz-Erregung kann vorschlagen, dass DRG sind anspruchsvolle vorläufige Integratoren Sinneseindrücke16,17. Diese neuen Erkenntnisse verleihen der DRG Explant die Eigenschaften eines Mini-neuronalen Netzwerk-Systems ähnlich wie bei anderen “Mini-Brain”-Modelle, die nervös-Gewebe-spezifische Organellen verwendet für breitere Experimentierfelder Untersuchung sind und therapeutische Umgang mit neurologischen Erkrankungen18,19. Diese Beweise zusammen mit der Tatsache, dass die DRG ein diskret und gut definierte Cluster neuronale Gewebe umgeben von Bindegewebe Kapsel ist, machen es eine geeignete Orgel für ex-Vivo -Transplantation.
Kultivierung Maus DRG präsentiert mehrzelligen attraktiv, menschliche Krankheitszuständen durch strukturelle und genetische Ähnlichkeiten zwischen den Spezies zu modellieren. Darüber hinaus ist eine große Sammlung von transgenen Mausstämme sehr förderlich für zukünftige mechanistische Studien. Neurit Verlängerung während der Entwicklung und nach einer Verletzung erfordert mechanische Wechselwirkungen zwischen Wachstum Kegel und Substrat20,21. Nano – und Mikro-gemusterten Substrate wurden als Werkzeuge, direkte Neuriten Auswuchs und demonstrieren ihre Fähigkeit, auf topografische Merkmale in ihrer Mikroumgebungen verwendet. Neuronen haben gezeigt, zu überleben, zu halten, migrieren und ihre Axone um Oberflächeneigenschaften wie Rillen in Substraten22,23navigieren zu orientieren. Aber diese Studien haben in der Regel kultivierten Zelllinien verwendet und es ist schwer vorherzusagen, wie primäre neuronalen Zellen wird auf klar definierte, körperliche Signale in Vivo und ex Vivoreagieren.
Ex-Vivo Explant Modell Maus DRG verwendet für diesen Vorschlag imitiert die echte Zell-Zell-Interaktion und biochemische Hinweise rund um wachsende Axone. Unter vielen verschiedenen experimentellen Paradigmen von axonalen Regeneration, Neurosphäre Produktion, bis hin zu Neuroinflammation, DRG explant weiterhin Modell als ein wertvolles Instrument zu untersuchen, die virale Infektion und Latenz Aspekt innerhalb von sensorischen dienen Ganglien24,25,26,27.
Das Nervensystem (NS) ist in der Regel Ziel für virale Infektionen28,29,30. Die meisten Viren infizieren Epithelzellen und endotheliale Zelloberflächen und ihren Weg von der Oberfläche Gewebe zu NS über periphere Nerven sensorische und motorische Fasern. Vor allem die Herpes-Simplex-Virus Typ 1 (HSV-1) nach ein Erstinfektion in epithelialen Zellen stellt eine lebenslange Latenz in den sensorischen Ganglien vorzugsweise die DRG der PNS31,32. HSV-1 Neuroptropic-Fähigkeit der PNS zu infizieren führt letztendlich zu neurologischen Erkrankungen33.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das ex-Vivo DRG Modell ist äußerst nützlich, um ein breites Spektrum an Veranstaltungen wie Neuron-Glia-Interaktion sowie die Wirkung der Mikroumgebung auf beiden neuronalen und Glia-Stoffwechsel-37zu untersuchen. Darüber hinaus das DRG-Modell als ein kostengünstiges Instrument ließe sich relevante Fragen bezüglich pathogenetischen Mechanismen und die damit verbundenen Marker für akute chronische und latente Phase der Infektion oder in einer bestimmten Krankheit ex- Vivo …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken die Bildgebung Kern-Anlage am Midwestern University (MWU) und der Gruppe der Studierenden [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo und Casey Sigerson] für ihre Beiträge in Zellkultur und imaging-Arbeit. Diese Forschungsarbeit wurde unterstützt von der MWU Intramurales Zuschüsse, M.F. und Forschung Startkapital, V.T.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
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