アダルト マウス後根神経節外植体し、解離細胞モデル神経可塑性とウイルス感染を含む環境の侮辱への応答を調査するため
Summary
ニューロン-グリア相互作用、神経可塑性、関連付けのメカニズムの広い範囲を調査するこのレポートで切片培養、マウス由来後根神経節細胞の初代培養の解離の利点が強調表示されます。neuroinflammation、およびウイルス感染への応答。
Abstract
このプロトコルでは、マウス由来の後根神経節 (DRG) 植と体外後根神経節由来培養の解離の感覚ニューロンとグリアの衛星細胞の前のヴィヴォモデルについて説明します。これらは様々 なニューロン-グリア相互作用、神経可塑性に至る末梢神経系 (PNS) の生理学的および病理学的条件に関連する生体の反応を調査するための便利で多機能なモデルです。neuroinflammation、およびウイルス感染。DRG 植の使い方は、複数の理由から単純な単一細胞モデルと比較して科学的に有利です。例えば、として、培養 DRG 植によりすべての神経細胞およびグリア細胞の機能に重要な役割を果たす細胞外微小環境を含む全体の神経ネットワークの転送前のヴィヴォ。さらに、DRG 植も維持できる前のヴィヴォとしてすることができますは、数日と培養条件の希望します。さらに、収穫の DRG がさらの第一次感覚ニューロンと神経細胞とグリア相互作用、神経突起形成、細胞と軸索のコーンの相互作用を調査するため衛星グリア細胞の生体外で共培養に解離することができます。微小環境、そしてより一般的な神経の代謝に関連するあらゆる側面。したがって、DRG 植システムは、多大なコスト効率の高い方法で生物学、生理学、病理学的条件に関連するイベントの広い配列を研究する柔軟性を提供します。
Introduction
本稿で報告するニューロン-グリアに至る PNS 侮辱に対する生体の応答の広い範囲を調査する保存の組織のような微小環境として派生したマウス後根神経節のモデル システムの切片ex vivoモデルを取得する方法相互作用、神経可塑性、ウイルス感染、炎症のマーカー。さらに、我々 はさらに後根神経節から派生した単一ニューロンと衛星細胞の共培養を作成するプロトコルを開発しました。
DRG は、衛星グレー-問題-単位脊髄神経の背側脊髄神経根に沿って中枢神経系 (CNS) の外側に位置します。DRG、椎間孔、家 pseudounipolar 感覚ニューロンと衛星細胞の近くに位置します。Pseudounipolar ニューロン細胞体へ周辺ターゲットから体性および内臓の入力を運ぶ末梢プロセスと中枢神経系に細胞体から感覚の情報を送信する中央のプロセスに分割単一の神経突起を備えています。結合カプセルを定義し、中枢神経系のニューロンとグリア細胞のこの周辺のクラスターを分離します。ローカルの幹細胞ニッチ、ライフ1で発生する神経因性のイベントを担当して生後細胞移動したり、DRG からこれまで説明されています。したがって、このモデルは成体、axonogenesis、咬合性外傷、および細胞死2,3,4,5,6,7 への応答の研究に特に適して ,8,9 。
再生に関する分野で体内から採取した DRG と explanted体外axonotmesis を再現、どの軸索が完全に切断された神経細胞の細胞体の損傷状態が神経ターゲット10 から切断されました。 ,11。末梢神経損傷は、DRG の減少と増加の遺伝子発現を引き起こす可能性が、これらの変更の多くは、再生プロセスの結果が免疫応答の非神経細胞から別の応答可能性がありますも多く知られています。前のヴィヴォを使用して孤立した後根神経節で、この複雑さのいくつかのシステムが削除され、生成経路をより簡単に調べることができます。
ほかに中枢神経系の GABA12,13,14,15神経相馬のレベルを含む多くの神経伝達物質の受容体の豊かさへの感覚入力を伝える上で中心的な役割と同様介在ニューロン間励起の証拠は、DRG が感覚入力16,17の洗練された予備的インテグレーターであることを提案するかもしれない。これらの新しい発見を与える DRG 植にミニ神経ネットワーク システム神経組織特異オルガノイドの調査のより広範な実験的フィールドの使用は、他の「ミニ脳」モデルと同様治療の特性神経疾患18,19へのアプローチ。DRG は神経組織に囲まれて結合カプセルの離散と明確に定義されたクラスターであるという事実と共にこれらの証拠はそれ前のヴィヴォ移植のために臓器を作る。
培養マウス後根神経節には、種の間の構造および遺伝の類似のため人間病態生理を持ってモデル化する魅力的な多細胞オプションが表示されます。さらに、トランスジェニック マウス系統の大規模なリポジトリは将来解明に非常に助長します。開発時および損傷後の神経突起の伸展成長円錐形、基板20,21力学的相互作用が必要です。ナノ-マイクロ パターン基板は、神経突起伸長を指示し、微小の地形に対応する能力を発揮するツールとして使用されています。ニューロンは、生き残るため、付着、移行、および基板22,23溝などの表面機能を操作する軸索の方向に示されています。しかし、これらの研究は、培養細胞を利用した通常、プライマリ神経細胞の意志を予測することは困難だ明確に定義された、物理的なキュー体内または体外への対応します。
マウス後根神経節この提案の使用の前のヴィヴォ植モデルは、実質細胞間相互作用と成長軸索を取り巻く生化学的手がかりを模倣します。多くの異なった実験パラダイムに至る軸索再生、neurosphere 生産 neuroinflammation、DRG 外植片の間でモデルは引き続き感覚内ウイルス感染と待ち時間の側面を調査するための貴重なツールとして大脳基底核24,25,26,27。
神経系 (NS) は、一般的にウイルス感染症28,29,30のターゲットです。ほとんどのウイルスは上皮と内皮細胞表面に感染し、感覚と運動線維末梢神経を介して NS に表面の組織から彼らの方法を作る。単純ヘルペス ウイルス タイプ 1 (HSV-1) 上皮細胞に初期感染は好ましくは、知覚神経節に生涯潜伏を確立後 PNS31,32の DRG。PNS に感染した HSV-1 neuroptropic 機能は、最終的に神経疾患33に します。
Protocol
Representative Results
Discussion
前のヴィヴォDRG モデルは、ニューロン ・ グリア相互作用などのイベントの広い範囲と同様、両方の神経細胞およびグリア代謝37の制御の効果を調査するため非常に便利です。さらに、DRG モデルをコスト効果の高いツールとして使用して、発症機序、関連マーカーの特定の疾患、感染症の急性の慢性および潜在期の ex vivoシステム開発に関連する質問に対処可?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々 は、細胞培養およびイメージングワークの彼らの貢献のため中西部大学 (MWU) と [Chanmoly ハンセン、クリストファー ・ Dipollina、ダリル ジャンバルヴォ ・ ケーシー シガーソン] 学生のグループでイメージングの中核施設を心から感謝します。この研究は私に m. f. や研究のスタートアップ資金を MWU の学内助成金によって支えられました。
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
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