성인 마우스 DRG Explant와 해리 셀 모델 Neuroplasticity 바이러스 성 감염을 포함 한 환경 모욕에 대 한 응답을 조사 하
Summary
이 보고서에서 organotypic 문화와 지 루트 마우스 파생 중추의 해리 주 문화의 장점 다양 한 메커니즘 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해와 관련 된 조사를 강조 표시 됩니다. neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염에 응답입니다.
Abstract
이 프로토콜 지 루트 마우스 파생 중추 (DRG) explant 및 생체 외에서 DRG 파생 공동 문화 해리 감각 신경 그리고 glial 위성 세포의 비보 전 모델을 설명합니다. 이들은 다양 한 생물학 응답 neuroplasticity, 상호 작용 신경 폐해에서 이르는 말 초 신 경계 (PNS)의 생리 적 및 병 적인 상태와 관련 된 조사를 유용 하 고 다재 다능 한 모델 neuroinflammation, 그리고 바이러스 성 감염입니다. DRG explant의 사용은 여러 이유로 단순한 단일 셀 모델에 비해 과학적으로 유리 하다. 예를 들어, organotypic 문화, DRG explant 비보 전 모든 신경 그리고 glial 기능에 중요 한 역할을 재생 하는 세포 외 microenvironment를 포함 하 여 전체 신경 네트워크의 전송을 수 있습니다. 또한, DRG explants 또한 유지할 수 있습니다 비보 전 위해 몇 일 및 문화 조건으로 불안정 수 있습니다 원하는. 또한, 수확된 DRG 수 수 더 해리를 생체 외에서 공동 문화에 기본 감각 신경 그리고 glial 신경 상호 작용, neuritogenesis, axonal 콘 상호는 extracellular 조사 위성 glial 세포의 microenvironment, 그리고 더 일반적으로, 신경 물질 대사와 관련 된 모든 측면. 따라서, DRG explant 시스템 유연성을 다양 한 비용 효율적인 방식으로, 생리 적, 생물 학적 및 병 적인 조건에 관련 된 이벤트를 연구의 큰 거래를 제공 합니다.
Introduction
이 원고에서 우리를 PNS 모욕 신경 폐해에서 배열에 생물학 응답의 넓은 범위를 조사 하는 보존된 조직 같은 microenvironment로 파생 된 마우스 DRG 모델 시스템의 organotypic ex vivo 모델을 받는 방법을 보고합니다 상호 작용, neuroplasticity, 염증 성 마커, 바이러스 성 감염. 또한, 우리는 더 DRG 파생 한 감각 신경 및 위성 세포의 기본 공동 문화를 만들려는 프로토콜 개발.
DRG는 위성 회색-문제-단위 척추 신경의 등 쪽 척추 뿌리 따라 중앙 신경 시스템 (CNS) 밖에 위치 해 있습니다. DRG, 척추 foramina의 근접에 있는 pseudounipolar 감각 뉴런 하며 위성 glial 세포. Pseudounipolar 신경 셀 시체 주변 대상에서 체세포와 내장 입력을 들고 주변 프로세스 및 CNS에 세포 체에서 감각 정보를 전송 하는 중앙 프로세스에 분할 단일 neurite 기능. 연결 캡슐 정의 CNS에서 신경 그리고 glial 세포의 주변이 클러스터를 분리 하 고. DRG에서 출생 후 셀 마이그레이션 없음 설명 적 이며 지방 줄기 세포 틈새 생활1에 걸쳐 발생 하는 neurogenic 이벤트에 대 한 책임. 따라서,이 모델은 특히 성체, axonogenesis, 외상 성 병 변, 및 세포 죽음2,3,,45,6,7 공부에 적합 ,,89 .
Neuroregeneration의 분야에는 DRG vivo에서 에서 수확 explanted 시험관에서 재현 axonotmesis, 신경 세포 체는 축 삭은 완전히 절단에 부상 상태 innervated 대상10에서 분리 ,11. 그것은 잘 알려져 주변 신경 상해는 DRG에 감소 및 증가 유전자 발현을 발생할 수 있습니다 및 이러한 변경의 많은 재생 프로세스의 결과 있지만 많은 비 신경 세포에서 면역 반응 또는 다른 결과 수도 있습니다. 비보 전 을 사용 하 여이 복잡성의 일부 고립 된 DRG의 시스템을 제거 하 고 기계적 경로 보다 쉽게 조사 수 있습니다.
CNS, 많은 신경 전달 물질 GABA12,13,,1415 신경 소마의 수준에서를 포함 하 여에 대 한 수용 체의 풍부에 감각 입력을 전달에 중앙의 역할 외에도 interneuronal 크로스-여기의 증거는 DRG 감각 입력16,17의 정교한 예비 통합자는 제안할 수 있습니다. 이러한 새로운 결과 부여 DRG explant에 비슷한 신경 조직 특정 organoids의 광범위 한 실험 분야에 사용 되는 다른 “미니 두뇌” 모델 및 치료 미니 신경 네트워크 시스템의 특성 신경 질환18,19에 접근. 이러한 증거는 사실은 DRG 연결 캡슐에 의해 포위 하는 신경 조직의 개별 및 잘 정의 된 클러스터 함께 비보 전 이식에 대 한 적합 한 장기 게.
자란 마우스 DRG 매력적인 다세포 옵션 종 간의 구조 및 유전적 유사성으로 인해 인간의 pathophysiologies 모델을 제공 합니다. 또한, 유전자 변형 마우스 긴장의 큰 저장소 미래 기계 론 적인 연구에 매우 도움이 되는. Neurite 확장 모두 개발 및 그 이후 부상 성장 콘 및 기판20,21사이 기계적인 상호 작용을 요구 한다. 나노 및 마이크로 패턴이 기판 neurite 결과와 그들의 microenvironments에서 지형 기능에 대응 하는 자신의 능력을 보여주는 도구로 사용 되었습니다. 뉴런, 준수, 마이그레이션, 생존과 기판22,23에 홈 같은 표면 기능 탐색에 그들의 축 삭의 방향을 표시 되었습니다. 그러나, 이러한 연구는 일반적으로 교양된 셀 라인 활용 하 고 어떻게 기본 신경 세포 지 예측 하기 어려운 비보 전또는 vivo에서 잘 정의 된, 물리적 신호에 응답.
마우스 사용이 제안에 대 한 DRG explant 모델 비보 전 진짜 셀 상호 작용 및 생 화 확 적인 신호 성장 축 삭을 둘러싼 모방 합니다. 많은 다른 neuroinflammation, axonal 재생, neurosphere 생산에서에서 배열 하는 실험적인 패러다임에서 DRG explant 가운데 모델 감각 내 바이러스 성 감염 및 대기 시간 측면을 조사 하는 유용한 도구 역할을 계속합니다 중추24,25,,2627.
신경 계통 (NS)는 일반적으로 바이러스 감염28,,2930에 대 한 대상입니다. 대부분 바이러스 감염 상피 그리고 내 피 세포 표면 그리고 주변 신경 통해 ns 표면 조직에서 그들의 방법을 감각 및 모터 섬유. 특히, 포진 심 플렉스 바이러스 타입 1 (HSV-1) 상피 세포에 초기 감염 감각 중추에 선호, 평생 대기 시간을 설정 후 PNS31,32의 DRG. PNS 감염 HSV-1 neuroptropic 기능 신경 질환33에 궁극적으로 지도 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo DRG 모델 두 신경 그리고 glial 대사37에 있는 microenvironment의 효과 뿐 아니라 신경 명과 상호 작용 등의 다양 한 스펙트럼을 조사 하기 위해 매우 유용 합니다. 또한, DRG 모델 병원 성 메커니즘 및 급성 만성 및 잠재성 단계 감염 또는 특정된 질병에 대 한 ex vivo 시스템 개발 하 여 마커를 관련 된 관련 된 질문을 해결 하기 위해 비용 효율적인 도구로 사용 될 수 있?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 진심으 세포 배양 및 이미징 작업에 그들의 공헌에 대 한 이미징 핵심 시설 중서부 대학 (MWU)와 [Chanmoly 셍, 크리스토퍼 Dipollina, 대 릴 Giambalvo, 그리고 케이시 Sigerson] 학생의 그룹에 감사 합니다. 이 연구 작업은 MWU의 Intramural 교부 V.T. M.F. 및 연구 시작 자금에 의해 지원 되었다
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
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