Взрослый мыши DRG Explant и отделить ячейки модели расследовать Нейропластичность и реагирования на экологические оскорблений, включая вирусной инфекции
Summary
В настоящем докладе выделены преимущества organotypic культур и диссоциированных первичных культур мыши производные Спинной корень ганглиев расследовать широкий спектр механизмов, связанных с нейрона глиальных взаимодействия, нейропластичности, neuroinflammation и ответ на вирусную инфекцию.
Abstract
Этот протокол описывает ex vivo модель мыши производные Спинной корень ганглиев (DRG) экспланта и в пробирке DRG-производные Сопредседатель культуры диссоциированных сенсорных нейронов и глиальных клеток Спутниковое. Это полезных и универсальных моделей расследовать целый ряд биологических реакций, связанных с физиологических и патологических условиях периферической нервной системы (ПНС), начиная от нейрона глиальных взаимодействия, нейропластичности, neuroinflammation и вирусные инфекции. Использование DRG экспланта научно выгодно по сравнению с упрощенным единичных клеток модели по нескольким причинам. Например как organotypic культуры, DRG экспланта позволяет ex vivo передачи всей нейронные сети, включая внеклеточного микроокружения, которые играют значительную роль в всех функций нейронов и глиальных. Кроме того DRG эксплантов могут также поддерживаться ex vivo на несколько дней и в условиях культуры может возмущенных как желаемой. Кроме того собранные DRG можно далее отделить в в пробирке совместно культуру первичных сенсорных нейронов и глиальных клеток Спутниковое расследовать нейронов и глиальных взаимодействия, neuritogenesis, аксональное конус взаимодействия с внеклеточного микроокружения и более общие, любой аспект, связанный с метаболизма нейронов. Таким образом системе DRG-экспланта предлагает большую гибкость для изучения широкий спектр событий, связанных с биологическим, физиологических и патологических условиях экономически эффективным образом.
Introduction
В этой рукописи мы приводим метод, чтобы получить модель ex vivo organotypic системы модель мыши производный DRG как сохранившиеся ткани как микроокружения расследовать широкий спектр биологических реакций на оскорбления ПНС, начиная от нейрона глиальных взаимодействие, нейропластичности, воспалительные маркеры, чтобы вирусной инфекции. Кроме того мы также разработали протокол для создания первичного совместного культуры DRG-производные одного сенсорных нейронов и спутниковое клетки.
DRG находятся спутниковое Грей вопрос подразделений, расположенных за пределами центральной нервной системы (ЦНС) вдоль наспинная спинномозговых корешков спинномозговых нервов. DRG, расположенный в непосредственной близости от межпозвонковых отверстий, дом pseudounipolar сенсорных нейронов и глиальных клеток Спутниковое. Pseudounipolar нейроны имеют одно neurite, который разбивает на периферийных процесс, перевозящих соматических и висцеральных вклад от периферийных целей клетки тела и центральный процесс, который передает сенсорную информацию от тела клеток в ЦНС. Соединительной капсулой определяет и изолирует этот периферийных кластера нейронов и глиальных клеток ЦНС. Миграция не послеродовой клеток или от DRG когда-либо были описаны и ниша местных стволовых клеток отвечает за нейрогенный события, происходящие на протяжении жизни1. Таким образом эта модель особенно подходит для изучения взрослых нейрогенез, axonogenesis, ответ на травматические поражения и клеток смерть2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
В области neuroregeneration DRG найденным в естественных условиях и описаны в vitro воспроизводит axonotmesis, травмы условие в котором аксоны полностью отделена и нейрональные клетки тела отключен от иннервируемые целевой10 ,11. Хорошо известно, что травмы периферических нервов может вызвать уменьшение и увеличение ген выражение в DRG и многие из этих изменений являются результатом процессов регенерации, но многие могут также быть результатом иммунного ответа или другой реакции от не нейрональных клеток. С помощью ex vivo системы изолированных DRG, некоторые из этой сложности удаляется и механистические пути могут расследоваться более легко.
Помимо его центральную роль в передаче сенсорные входы в ЦНС, обилие рецепторов для многих нейромедиаторов, включая ГАМК12,13,,1415 на уровне нейрональных сома, а также свидетельства о interneuronal кросс возбуждения может предположить, что DRG сложных предварительных интеграторы сенсорные входы16,17. Эти новые выводы возлагают на эксплант DRG характеристики системы мини нейронной сети похож на другие модели «мини-мозг», которые являются organoids нервной ткани специфичные для более широких экспериментальных областях расследования и терапевтических подход к неврологических заболеваний18,19. Эти свидетельства, а также тот факт, что DRG кластер состоит из дискретных и четко нейронной ткани окружены соединительной капсулой, сделать его подходящим органом для трансплантации ex vivo .
Культивирования мыши DRG представляет многоклеточных привлекательным для моделирования человеческого pathophysiologies из-за структурных и генетические сходства между видами. Кроме того большой репозиторий штаммов трансгенные мыши является весьма благоприятной для будущих механистический исследований. Neurite расширение как во время разработки, так и после травмы требует механического взаимодействия между роста конуса и субстрат20,21. Нано – и микро узорные субстраты используются в качестве инструментов прямым следствием neurite и продемонстрировать их способность реагировать на топографических особенностей в их микросреды. Нейроны было показано, чтобы выжить, присоединиться, миграции и ориентировать их аксоны ориентироваться особенности поверхности такие пазы в субстратов22,23. Однако, эти исследования обычно использовали искусственный клеточных линий и трудно предсказать, как начальных нейрональные клетки будет реагировать на четко определенных, физические сигналы в естественных условиях или ex vivo.
Ex vivo экспланта модель мыши DRG, используемые для этого предложение имитирует реальную ячеек взаимодействия и биохимические сигналы вокруг растущего аксоны. Среди многих различных экспериментальных парадигм, начиная от аксональное регенерации, производство нейросферы, neuroinflammation, DRG explant модель продолжает служить ценным инструментом для изучения вирусной инфекции и латентность аспект в сенсорные ганглии24,25,,2627.
Нервной системы (NS) в целом является мишенью для вирусных инфекций28,29,30. Большинство вирусов заразить поверхности эпителиальных и эндотелиальных клеток и сделать их путь от поверхности ткани NS через периферических нервов сенсорные и моторные волокна. В частности, вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1) после первоначальной инфекции в эпителиальных клетках устанавливает пожизненный задержка в сенсорных ганглиев желательно, DRG ПНС31,32. HSV-1 neuroptropic возможность заражения ПНС в конечном итоге приводит к33неврологических заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo DRG модель является чрезвычайно полезным для изучения широкого спектра мероприятий, таких как нейрон глии взаимодействия, а также влияния микроокружения на обоих нейронов и глиальных метаболизм37. Кроме того DRG-модель может использоваться как экономически эффекти?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы искренне благодарим изображений ядра объекта на среднем западе университета (MWU) и группа студентов [Сенг Chanmoly, Кристофер Dipollina, Дэррил Giambalvo и Кейси Сигерсон] за их вклад в культуре клеток и изображений работу. Эта исследовательская работа была поддержана MWU в очной грантовое финансирование м.ф. и исследования средств запуска для в.т.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
Referências
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neurociência. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neurociência. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neurociência. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A., McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Whitley, R., Kimberlin, . D. W., Prober, C. G., Arvin, A., et al. . Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
