Yetişkin fare DRG Explant ve nöroplastisite ve Viral enfeksiyon da dahil olmak üzere çevre hakaret yanıtlar araştırmak için hücre modelleri ayrışmış
Summary
Bu raporda, organotypic ve fare kaynaklı dorsal kök gangliyon Disosiye birincil kültürler avantajları ile nöron gliyal etkileşim, nöroplastisite ilişkili mekanizmaları geniş bir araştırmaya vurgulanır, neuroinflammation ve viral enfeksiyon yanıt.
Abstract
Bu iletişim kuralı bir ex vivo modeli fare kaynaklı dorsal kök gangliyon (DRG) explant ve vitro DRG kaynaklı ortak kültür Disosiye duyusal sinir hücreleri ve gliyal uydu hücre açıklar. Bunlar biyolojik yanıt periferik sinir sistemi (PNS) nöron gliyal müdahalesini nöroplastisite değişen fizyolojik ve patolojik şartlar ile ilişkili çeşitli araştırmak için yararlı ve çok yönlü modellerdir, neuroinflammation ve viral enfeksiyon. DRG explant kullanımı için birden çok nedeni basit tek hücreleri modellerle karşılaştırıldığında bilimsel olarak avantajlıdır. Örneğin, bir organotypic kültür olarak DRG explant tüm nöronal ve gliyal işlevlerin önemli bir rol oynamaktadır ekstraselüler microenvironment de dahil olmak üzere tüm nöronal ağa ex vivo transferini sağlar. Ayrıca, DRG explants da ex vivo birkaç gün ve kültür koşulları olarak tedirgin için istenen korunabilir. Buna ek olarak, hasat DRG daha fazla birincil duyusal sinir hücreleri ve uydu gliyal hücreler gliyal nöronal etkileşim, neuritogenesis, hücre dışı etkileşim aksonal koni araştırmak için bir vitro ortak kültür içine ayrışmış microenvironment ve daha fazla genel, nöronal metabolizma ile ilişkili herhangi bir yönü. Bu nedenle, DRG-explant sistemi büyük bir maliyet-etkin bir şekilde biyolojik, fizyolojik ve patolojik koşulları için ilgili olayların geniş bir dizi çalışma için esneklik sağlar.
Introduction
Bu makale, biz biyolojik yanıt nöron-gliyal gelen değişen PNS hakaret için geniş bir araştırmaya korunmuş bir doku gibi microenvironment olarak türetilmiş fare DRG modeli sistemi bir organotypic ex vivo modeli elde etmek için bir yöntem raporu etkileşim, nöroplastisite, inflamatuar işaretlere, viral enfeksiyon. Buna ek olarak, biz daha DRG elde edilen tek duyusal sinir hücreleri ve uydu hücreleri birincil co kültürünü oluşturmak için bir protokol tarafından geliştirilmiştir.
DRG uydu gri-madde-birimler merkezi sinir sistemi (MSS) dışında spinal sinirlerin dorsal omurga kökleri yer alan bulunmaktadır. İntervertebral foramina, ev pseudounipolar duyusal sinir hücreleri ve uydu gliyal hücrelerini yakınlığı bulunan DRG. Pseudounipolar nöronlar çevresel hedefler somatik ve viseral girişlerden hücre vücuda taşıyan bir periferik süreci ve MSS hücre vücuttan duyusal bilgileri gönderir bir merkezi işlem böler tek bir neurite sahiptir. Bir bağ kapsül tanımlar ve bu periferik kümeden nöronlar ve gliyal hücreler MSS izole ediyor. DRG bilgisayardan veya doğum sonrası hücre geçiş yoktur şimdiye kadar açıklanan ve bir yerel kök hücre niş yaşam1gerçekleşen Nörojenik olayların sorumludur. Bu nedenle, bu model yetişkin neurogenesis, axonogenesis, travmatik lezyonu ve hücre ölüm2,3,4,5,6,7 yanıt çalışmak özellikle uygundur ,8,9 .
Neuroregeneration alanında, DRG vivo içinde –dan hasat ve explanted vitro axonotmesis üretir, bir yaralanma durumu hangi aksonlar tamamen kopmuş ve nöronal hücre vücut innervated hedef10 kesilir ,11. Iyi periferik sinir yaralanma azalan ve artan gen ekspresyonu DRG neden olabilir ve bu değişiklikleri birçok Rejeneratif işlemler sonucu ama çoğu da bağışıklık yanıtı veya başka bir yanıt nöronal olmayan hücrelerden bir sonucu olabilir bilinmektedir. Bir ex vivo kullanarak bu karmaşıklığı bazılarına izole DRG sistemi kaldırılır ve mekanik yollar daha kolay soruşturma olmaktır.
MSS, bereket için nöronal soma düzeyde GABA12,13,14,15 de dahil olmak üzere birçok nörotransmitter reseptörlerinin duyusal girdilerin taşıma merkezi rolü yanı sıra yanı sıra kanıt interneuronal çapraz-uyarma DRG sofistike ön entegratörleri duyusal girdiler16,17olduğunu önerebilir miyim? Bu yeni bulgular DRG explant için bir mini-nöronal ağ sistemi sinir doku özel organoids daha geniş deneysel araştırma alanları için kullanılan diğer “Mini beyin” modelleri, benzer ve tedavi edici özellikleri görüşmek. nörolojik hastalıklar18,19yaklaşım. Bu delillerin DRG ayrık ve iyi tanımlanmış küme nöronal doku bağ bir kapsül tarafından çevrili olması ile birlikte uygun bir organ ex vivo nakli için yapmak.
Kodlamayla fare DRG türler arasında yapısal ve genetik benzerlikler nedeniyle insan pathophysiologies model çekici çok hücreli seçeneğini sunar. Ayrıca, büyük bir depo transgenik fare suşlarının gelecekteki mekanik çalışmaları için son derece elverişli. Neurite uzantısı geliştirme sırasında ve yaralanma sonra büyüme koni ve substrat20,21arasındaki mekanik etkileşim gerektirir. Nano ve mikro desenli yüzeyler araçları olarak neurite çıkıntı yönlendirmek ve onların microenvironments topografik özellikleri yanıt kapasitelerini göstermek için kullanılmıştır. Nöronlar hayatta, uygun, göç ve yüzey şekil öyle aynı derecede yiv yüzeylerde22,23içinde gezinmek için onların aksonlar şark gösterilmiştir. Ancak, bu çalışmalar genellikle kültürlü hücre hatları kullanılan ve nasıl olacak birincil nöronal hücre tahmin etmek zordur iyi tanımlanmış, fiziksel ipuçları vivo içinde veya ex vivoyanıt.
Fare bu öneri için kullanılan DRG ex vivo explant modelinin gerçek hücre-hücre etkileşim ve biyokimyasal ipuçları büyüyen aksonlar çevreleyen taklit eder. Çok deneysel paradigmalar aksonal rejenerasyon, neurosphere üretim, neuroinflammation için değişen DRG explant farklı arasında modeli içinde duyusal viral enfeksiyon ve gecikme yönüdür araştırmak için değerli bir araç olarak hizmet vermeye devam etmektedir gangliyon24,25,26,27.
Sinir sistemi (NS) genel olarak viral enfeksiyonlar28,29,30için hedeftir. Virüslerin çoğu epitel ve endotel hücre yüzeyleri bulaştırmak ve duyusal ve motor lifler NS periferik sinirleri ile yüzey dokusundan onların yol yapmak. Özellikle, herpes simpleks virüsü tip 1 (HSV-1) ilk enfeksiyon epitel hücrelerdeki yaşam boyu süren bir gecikme süresi tercihen, duyusal gangliyon kurar sonra PNS31,32DRG. PNS bulaşmasını HSV-1 neuroptropic yeteneği sonuçta nörolojik hastalıklar33‘ e yol açar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo DRG modeli geniş bir spektrum nöron-glia etkileşim gibi olayların yanı sıra her iki nöronal ve gliyal metabolizma37microenvironment etkisini araştırmak son derece yararlıdır. Ayrıca, DRG modelinin maliyet-etkin bir araç olarak patojenik mekanizması ile ilgili olarak ve enfeksiyon veya belirli bir hastalık akut kronik ve gizli faz için ex vivo sistemleri geliştirerek imleyicileri ilişkili ilgili soruları gidermek kullanılabilir. Buna ek olarak, tarama k…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz içtenlikle görüntüleme çekirdek-tesis Midwestern Üniversitesi (MWU) ve öğrencilerin [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo ve Casey Sigerson] grup hücre kültürü ve iş Imaging katkılarından dolayı teşekkür ederiz. Bu araştırma çalışmaları MWU’ın Intramural grant V.T. M.F. ve araştırma başlangıç fonlar için finansman tarafından desteklenen
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
Referências
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neurociência. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neurociência. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neurociência. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A., McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Whitley, R., Kimberlin, . D. W., Prober, C. G., Arvin, A., et al. . Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
