Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad
Summary
En este informe, se destacan las ventajas de las culturas organotypic y disociadas cultivos primarios de ganglios de raíz dorsal derivadas de ratón para investigar una amplia gama de mecanismos asociados a la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la respuesta a la infección viral.
Abstract
Este protocolo describe un modelo ex vivo de raíz dorsal de ratón derivados ganglios (DRG) explante y en vitro derivados de DRG Co cultura de disociado de las neuronas sensoriales y las células glial satélite. Estos son modelos versátiles y útiles para investigar una variedad de respuestas biológicas asociadas con condiciones fisiológicas y patológicas del sistema nervioso periférico (PNS) que van desde la interacción neuronal-glial, neuroplasticidad, neuroinflamación y la infección viral. El uso de explantes de DRG es científicamente ventajoso en comparación con las células simples modelos por múltiples razones. Por ejemplo, como una cultura organotypic, explante GRD permite a transferencia ex vivo de toda una red neuronal como el microambiente extracelular que juegan un papel significativo en todas las funciones neuronales y gliales. Además, DRG explantes pueden también mantener ex vivo para varios días y las condiciones de cultivo pueden ser perturbadas como deseado. Además, el DRG cosechado puede ser disociado más en una cultura Co en vitro de neuronas sensoriales primarias y células glial satélite para investigar la interacción neuronal-glial, neuritogenesis, cono axonal interacción con el medio extracelular microambiente y más general, cualquier aspecto asociado con el metabolismo neuronal. Por lo tanto, el sistema de DRG-explante ofrece una gran flexibilidad para estudiar una amplia gama de eventos relacionados con las condiciones biológicas, fisiológicas y patológicas de una manera rentable.
Introduction
En este manuscrito, se presenta un método para obtener un modelo ex vivo de organotypic de un sistema de modelo de ratón derivado DRG como un microambiente como tejido conservado para investigar una amplia gama de respuestas biológicas a los insultos PNS desde neuronal-glial interacción, neuroplasticidad, marcadores inflamatorios, infección viral. Además, hemos desarrollado un protocolo para crear una cultura co primaria de derivados de DRG solo neuronas sensoriales y las células satélite.
El DRG son gris-materia-unidades satélite situadas fuera de sistema nervioso central (SNC) a lo largo de las raíces espinales dorsales de los nervios espinales. El DRG, situado en la proximidad de los agujeros intervertebrales, las neuronas sensoriales pseudounipolares casa y células gliales por satélite. Las neuronas pseudounipolares tienen una sola neurita que se divide en un proceso periférico lleva entradas somáticas y viscerales de objetivos periféricos al cuerpo de la célula y un proceso central que envía información sensorial del cuerpo celular en el SNC. Una cápsula de tejido conectiva define y aísla esta agrupación periférica de neuronas y células gliales del SNC. Sin migración celular postnatal desde el DRG o nunca se ha descrito y un nicho de células madre local es responsable de eventos neurógeno, que ocurre a lo largo de la vida1. Por lo tanto, este modelo es particularmente adecuado para el estudio de la neurogénesis adulta, axonogenesis, respuesta a la lesión traumática y la célula muerte2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
En el campo de Neurorregeneración, el DRG extraídas en vivo y explantado en vitro reproduce axonotmesis, una condición de la lesión en que axones son totalmente roto y el cuerpo neuronal de la célula está desconectada del destino inervados10 ,11. Es bien sabido que lesión periférica del nervio puede causar expresión génica disminución y aumento en el DRG y muchos de estos cambios son el resultado de procesos regenerativos pero muchos también pueden ser el resultado de la respuesta inmune u otra respuesta de las células no neuronales. Mediante el uso de un ex vivo sistema de DRG aislado, algunos de esta complejidad se elimina y vías mecanicistas pueden investigarse más fácilmente.
Además de su papel central en transporte entradas sensoriales al SNC, la abundancia de receptores para muchos neurotransmisores como GABA12,13,14,15 a nivel del soma neuronal, así como evidencia de excitación de Cruz interneuronal puede sugerir que DRG son sofisticados integradores preliminares de entradas sensoriales16,17. Estos nuevos hallazgos confieren al explante DRG las características de un sistema de red mini-neuronal similar a otros modelos “mini cerebro”, que son específicos de tejido nervioso organitas utilizado para campos experimentales más amplio de investigación y terapéutica enfoque a enfermedades neurológicas18,19. Estas evidencias junto con el hecho de que el GRD es un grupo discreto y bien definido de tejido neuronal rodeado por una cápsula de tejido conectiva, hacen que sea un órgano adecuado para el trasplante de vivo ex .
Cultivo ratón DRG presenta una opción atractiva multicelular modelo pathophysiologies humanas debido a las similitudes estructurales y genéticas entre las especies. Además, un gran repositorio de cepas de ratón transgénico es muy propicio para futuros estudios mecanicistas. Extensión del neurite tanto durante el desarrollo y después de la lesión requiere interacciones mecánicas entre crecimiento cono y sustrato20,21. Nano – y micro-patrón sustratos se han utilizado como herramientas para dirigir la consecuencia del neurite y demostrar su capacidad para responder a las características topográficas en sus microambientes. Han demostrado las neuronas para sobrevivir, se adhieren, migran y orientar sus axones para navegar características superficiales como surcos en sustratos,,2223. Sin embargo, estos estudios han utilizado típicamente líneas de cultivo de células y es difícil predecir cómo primarios neuronales células voluntad responde a pautas bien definidas, física en vivo o ex vivo.
El modelo de explante ex vivo del ratón DRG utilizado para esta propuesta imita la interacción célula-célula real y señales bioquímicas que rodea los axones creciente. Entre muchos diferentes paradigmas experimentales que van desde la regeneración axonal, desarrolló la producción, neuroinflamación, el DRG explante modelo continúa sirviendo como una herramienta valiosa para investigar el aspecto de la infección y la latencia viral en sensorial los ganglios24,25,26,27.
El sistema nervioso (NS) en general es blanco para infecciones virales28,29,30. Mayoría de los virus infecta las superficies de células epiteliales y endoteliales y hace su camino desde la superficie del tejido a NS a través de nervios periféricos las fibras sensoriales y motoras. En particular, el virus del herpes simple tipo 1 (HSV-1) después de una infección inicial en las células epiteliales establece un estado de vida latente en los ganglios sensoriales preferiblemente, el DRG del PNS31,32. HSV-1 neuroptropic capacidad de infectar el PNS en último término conduce a enfermedades neurológicas33.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo ex vivo DRG es muy útil para investigar una amplia gama de eventos como interacción neurona-glia, así como el efecto del microambiente en ambos el metabolismo neuronal y glial37. Además, el DRG-modelo podría utilizarse como una herramienta rentable para abordar preguntas relevantes sobre el mecanismo patogénico y asociado marcadores desarrollando ex vivo sistemas para fase aguda crónica y latente de la infección o de una determinada enfermedad. Además, una bibl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos sinceramente las instalaciones centrales de la proyección de imagen en Midwestern Universidad (Uth) y el grupo de estudiantes [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo y Casey Sigerson] por sus contribuciones en cultivo celular y trabajo de imagen. Este trabajo de investigación fue apoyado por donaciones de la Uth Intramural fondos fondos de puesta en marcha M.F. e investigación a V.T.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
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