Voksen mus DRG Explant og dissosiert celle modeller for å undersøke Neuroplasticity og Svar å miljømessige fornærmelser inkludert virusinfeksjon
Summary
I denne rapporten uthevet fordelene med organotypic kulturer og dissosiert primære kulturer av mus-avledet dorsal root Ganglion for å undersøke en rekke mekanismer knyttet Nevron-glial interaksjon, neuroplasticity, neuroinflammation, og respons på virusinfeksjon.
Abstract
Denne protokollen beskriver en ex vivo modell av mus-avledet dorsal root Ganglion (DRG) explant og i vitro DRG-avledet co kultur dissosiert sensoriske neurons og satellitt gliacellene. Dette er nyttig og allsidig modeller for å undersøke en rekke biologiske svar forbundet med fysiologiske og patologiske tilstander av det perifere nervesystemet (PNS) fra Nevron-glial interaksjon, neuroplasticity, neuroinflammation og viral infeksjon. Bruken av DRG explant er vitenskapelig fordelaktig forhold til enkle enkeltceller modeller av flere grunner. For eksempel, som en organotypic kultur innrømmer DRG explant ex vivo overføring av en hel nevrale nettverk inkludert den ekstracellulære microenvironment spiller en viktig rolle i alle neuronal og glial funksjoner. Videre kan DRG explants også vedlikeholdes ex vivo for flere dager og kultur forhold kan være opprørt som ønsket. I tillegg enzymene til høstet DRG ytterligere i en i vitro co kultur primære sensoriske neurons og satellitt gliacellene undersøke neuronal-glial interaksjon, neuritogenesis, axonal kjegle samspill med den ekstracellulære microenvironment, og mer generelt, ethvert aspekt knyttet til nevronale metabolismen. Derfor gir DRG-explant systemet mye fleksibilitet til å studere en rekke hendelser knyttet til biologiske, fysiologiske og patologiske forhold på en kostnadseffektiv måte.
Introduction
I dette manuskriptet rapportere vi en metode for å få en organotypic ex vivo modell av en musen stammer DRG modellsystem som en bevarte vev-lignende microenvironment å undersøke et bredt spekter av biologiske Svar å PNS fornærmelser fra Nevron-glial samhandling, neuroplasticity, inflammatoriske markører, viral infeksjon. Dessuten, utviklet vi ytterligere en protokoll for å skape en primær co DRG-avledet enkelt sensoriske neurons og satellitt celler.
DRG er satellitt grå-saken-enheter plassert utenfor sentralnervesystemet (CNS) langs dorsal spinal røttene spinalnerver. Den DRG, ligger i nærheten av intervertebral foramina, house pseudounipolar sensoriske neurons og satellitt gliacellene. Pseudounipolar neurons har et enkelt neurite som deles i en ekstern prosess bærer somatiske og visceral inndata fra eksterne mål til celle kroppen, og en sentral prosess som sender sensoriske informasjonen fra celle kroppen til CNS. En connective kapsel definerer og isolerer denne eksterne klyngen av neurons og gliacellene fra CNS. Ingen postnatal celle migrasjon til eller fra DRG har noensinne blitt beskrevet og en lokal stamcelleforskningen nisje er ansvarlig for neurogenic hendelser hele livet1. Denne modellen er derfor spesielt godt egnet til å studere voksen neurogenesis, axonogenesis, svar på traumatisk lesjon, og celle død2,3,4,5,6,7 ,8,9 .
Innen neuroregeneration, DRG høstet fra in vivo og explanted i vitro gjengir axonotmesis, en skade tilstand som axons er fullt kuttet og neuronal celle kroppen er koblet fra innervated målet10 ,11. Det er kjent at eksterne nerve skade kan føre til redusert og økt genuttrykk i DRG og mange av disse endringene er et resultat av regenererende prosesser men mange kan også være et resultat av immunrespons eller et annet svar fra ikke-neuronal celler. Ved hjelp av en ex vivo system av isolerte DRG, noen av denne kompleksiteten fjernes og mekanistisk trasé lettere kan undersøkes.
Foruten sin sentrale rolle i å formidle sensoriske innganger til CNS overflod av reseptorer for mange nevrotransmittere inkludert GABA12,13,14,15 på nivå med neuronal soma samt bevis på interneuronal cross-eksitasjon kan foreslå at DRG er sofistikert foreløpige integratorer sensoriske innganger16,17. Disse nye funn tildele til DRG explant egenskapene til et mini-nevrale nettverk system ligner andre “mini brain” modeller, som er nervøs vev-spesifikke organoids brukes for bredere eksperimentell felt av etterforskning og terapeutiske tilnærming til nevrologiske sykdommer18,19. Disse bevisene sammen med det faktum at DRG er en diskret og veldefinert klynge av neuronal vev omgitt av en connective kapsel, gjør det til et egnet organ for ex vivo transplantasjon.
Dyrking musen DRG presenterer et attraktivt flercellet alternativ å modellere menneskelige pathophysiologies på grunn av strukturelle og genetiske likheter mellom artene. I tillegg er et stort register av transgene musen stammer svært fremmer fremtidige mekanistisk studier. Neurite forlengelsen både under utbyggingen og etter skade krever mekanisk samhandlinger mellom vekst kjegle og underlaget20,21. Nano – og mikro-mønstret underlag har blitt brukt som verktøy til å direkte neurite utvekst og demonstrere deres evne til å svare på topografiske egenskaper i deres microenvironments. Neurons har vist seg å overleve, følge, overføre og orientere sine axons å navigere overflaten funksjoner som spor i substrater22,23. Men disse studiene har vanligvis benyttet kulturperler linjer og det er vanskelig å forutsi hvordan primære neuronal celler vil svare godt definert, fysiske signaler i vivo eller ex vivo.
Explant ex vivo modell av musen DRG brukes for dette forslaget etterligner ekte celle-celle samhandling og biokjemiske indikatorer rundt voksende axons. Blant mange forskjellige eksperimentelle paradigmer mellom axonal gjenfødelse, neurosphere produksjon, neuroinflammation, DRG explant fortsetter modellen å tjene som et verdifullt verktøy for å undersøke det viral infeksjon og ventetid aspektet i Sensorisk Ganglion24,25,26,27.
Nervesystemet (NS) er generelt mål for virusinfeksjoner28,29,30. De fleste virus infisere epitel og endothelial celle overflater og komme seg fra overflaten vevet til NS via eksterne nerve sensorisk og motor fibre. Spesielt herpes simplex virus type 1 (HSV-1) etter en innledende infeksjon i epitelceller etablerer en livslang ventetid i de sensoriske Ganglion helst DRG av PNS31,32. HSV-1 neuroptropic evnen til å infisere PNS til slutt fører til nevrologiske sykdommer33.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ex vivo DRG modellen er svært nyttig å undersøke et bredt spekter av hendelser som Nevron-glia interaksjon og effekten av microenvironment på begge neuronal og glial metabolisme37. Videre kan DRG-modellen brukes som et kostnadseffektivt verktøy for å løse spørsmål angående patogene mekanisme og tilknyttede indikatorer ved å utvikle ex vivo systemer for akutt kronisk og latente fasen av infeksjon eller i en bestemt sykdom. I tillegg utnytte en screening bibliotek av sm?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker hjertelig Imaging core-anlegget på Midwestern University (MWU) og gruppen av elever [Chanmoly Seng, Christopher Dipollina, Darryl Giambalvo og Casey Sigerson] for deres bidrag i cellekultur og tenkelig arbeid. Dette forskningsarbeidet ble støttet av MWU’S Intramural gi finansiering MF og forskning oppstart penger til V.T.
Materials
| Adult Mice NIH/Swiss | Harlan Laboratories | ||
| 35mm petri dish | Cell Treat | 229635 | |
| Matrigel ECM | Sigma-Aldrich | E1270 | gelatinous protein mixture |
| F12 Media | Gibco | 11765-054 | *Part of SFM media |
| Collagenase IV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | 25200-056 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F6178 | |
| 0.22um filter | BD Falcon | 352350 | |
| Neurobasal media | Gibco | 10888-022 | |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | Supplement for neuronal culture |
| PSN antibiotics | Gibco | 15640-055 | *Part of SFM media Antibiotic mixture |
| L-glutamate | Sigma-Aldrich | G7513 | *Part of SFM media |
| NGF | Alomone Labs | N-100 | Nerve growth factor |
| Laminin coated coverslide | Neuvitro | GG-14-Laminin | |
| ONPG subtrate | Pierce | 34055 | |
| X-gal | Invitrogen | 15520034 | |
| Antibody anti-B-tubulin | Sigma-Aldrich | T8328 | 1:2000 dilution |
| Antibody anti-peripherin | Millipore | AB1530 | 1:1000 dilution |
| Hoechst dye | Thermo Fisher | 62249 | 1.5 µM final concentration |
| Anti-heparan sulfate | US Biological | H1890-10 | 0.180555556 |
| Anti gD antibody | Virostat | 196 | 1:10 dilution |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153-100G | *Part of SFM media |
| BME | Gibco | 21010-046 | *Part of SFM media |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | *Part of SFM media |
| KIT (Insulin-transferrin-Selenium-A) | Gibco | 51300-044 | *Part of SFM media |
| Vitamin-C | Sigma-Aldrich | A4403 | *Part of SFM media |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P7505 | *Part of SFM media |
| 488 (goat anti-mouse) | Life Technologies | A11029 | |
| Cy3 (goat anti-rabbit) | Jackson Immunoresearch laboratories | 111-165-003 | |
| Normal Goat serum | Vector | S-1000 | |
| Formalin Solution | Sigma-Aldrich | HT5014-120ML | |
| PBS | Gibco | 10010-031 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284-500ML | |
| VectaShield | Vector | H-1500 | Flurescence mount |
| Diamond White Glass Coverslides | Globe Scientific | 1380-20 |
Referências
- Muratori, L., et al. Generation of new neurons in dorsal root Ganglia in adult rats after peripheral nerve crush injury. Neural Plast. , 860546 (2015).
- Dellarole, A., Grilli, M. Adult dorsal root ganglia sensory neurons express the early neuronal fate marker doublecortin. J Comp Neurol. 511 (3), 318-328 (2008).
- Devor, M., Govrin-Lippmann, R. Neurogenesis in adult rat dorsal root ganglia. Neurosci Lett. 61 (1-2), 189-194 (1985).
- Farel, P. B., Boyer, A. Transient effects of nerve injury on estimates of sensory neuron number in juvenile bullfrog. J Comp Neurol. 410 (2), 171-177 (1999).
- Geuna, S., Borrione, P., Poncino, A., Giacobini-Robecchi, M. G. Morphological and morphometrical changes in dorsal root ganglion neurons innervating the regenerated lizard tail. Int J Dev Neurosci. 16 (2), 85-95 (1998).
- La Forte, R. A., Melville, S., Chung, K., Coggeshall, R. E. Absence of neurogenesis of adult rat dorsal root ganglion cells. Somatosens Mot Res. 8 (1), 3-7 (1991).
- Pannese, E. Investigations on the Ultrastructural Changes of the Spinal Ganglion Neurons in the Course of Axon Regeneration and Cell Hypertrophy I. Changes during Axon Regeneration. Z Zellforsch Mikrosk Anat. 60, 711-740 (1963).
- Popken, G. J., Farel, P. B. Sensory neuron number in neonatal and adult rats estimated by means of stereologic and profile-based methods. J Comp Neurol. 386 (1), 8-15 (1997).
- Tandrup, T. Unbiased estimates of number and size of rat dorsal root ganglion cells in studies of structure and cell survival. J Neurocytol. 33 (2), 173-192 (2004).
- Sarikcioglu, L., et al. Effect of severe crush injury on axonal regeneration: a functional and ultrastructural study. J Reconstr Microsurg. 23 (3), 143-149 (2007).
- Varejao, A. S., et al. Functional and morphological assessment of a standardized rat sciatic nerve crush injury with a non-serrated clamp. J Neurotrauma. 21 (11), 1652-1670 (2004).
- Hanack, C., et al. GABA blocks pathological but not acute TRPV1 pain signals. Cell. 160 (4), 759-770 (2015).
- Pagadala, P., et al. Loss of NR1 subunit of NMDARs in primary sensory neurons leads to hyperexcitability and pain hypersensitivity: involvement of Ca(2+)-activated small conductance potassium channels. J Neurosci. 33 (33), 13425-13430 (2013).
- Zhang, X. L., Albers, K. M., Gold, M. S. Inflammation-induced increase in nicotinic acetylcholine receptor current in cutaneous nociceptive DRG neurons from the adult rat. Neurociência. 284, 483-499 (2015).
- Zhu, Y., Lu, S. G., Gold, M. S. Persistent inflammation increases GABA-induced depolarization of rat cutaneous dorsal root ganglion neurons in vitro. Neurociência. 220, 330-340 (2012).
- Amir, R., Devor, M. Functional cross-excitation between afferent A- and C-neurons in dorsal root ganglia. Neurociência. 95 (1), 189-195 (2000).
- Kim, Y. S., et al. Coupled Activation of Primary Sensory Neurons Contributes to Chronic Pain. Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (5), 332-343 (2009).
- Dickson, B. J. Molecular mechanisms of axon guidance. Science. 298 (5600), 1959-1964 (2002).
- Miller, C., Shanks, H., Witt, A., Rutkowski, G., Mallapragada, S. Oriented Schwann cell growth on micropatterned biodegradable polymer substrates. Biomaterials. 22 (11), 1263-1269 (2001).
- Clark, P., Connolly, P., Curtis, A. S., Dow, J. A., Wilkinson, C. D. Topographical control of cell behaviour: II. Multiple grooved substrata. Development. 108 (4), 635-644 (1990).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Retrograde axon transport of herpes simplex virus and pseudorabies virus: a live-cell comparative analysis. J Virol. 84 (3), 1504-1512 (2010).
- Holland, D. J., Miranda-Saksena, M., Boadle, R. A., Armati, P., Cunningham, A. L. Anterograde transport of herpes simplex virus proteins in axons of peripheral human fetal neurons: an immunoelectron microscopy study. J Virol. 73 (10), 8503-8511 (1999).
- Sharthiya, H., Seng, C., Van Kuppevelt, T. H., Tiwari, V., Fornaro, M. HSV-1 interaction to 3-O-sulfated heparan sulfate in mouse-derived DRG explant and profiles of inflammatory markers during virus infection. J Neurovirol. 23 (3), 483-491 (2017).
- Zerboni, L., et al. Herpes simplex virus 1 tropism for human sensory ganglion neurons in the severe combined immunodeficiency mouse model of neuropathogenesis. J Virol. 87 (5), 2791-2802 (2013).
- Koyuncu, O. O., Hogue, I. B., Enquist, L. W. Virus infections in the nervous system. Cell Host Microbe. 13 (4), 379-393 (2013).
- Swanson, P. A., McGavern, D. B. Viral diseases of the central nervous system. Curr Opin Virol. 11, 44-54 (2015).
- Tyler, K. L. Emerging viral infections of the central nervous system: part 2. Arch Neurol. 66 (9), 1065-1074 (2009).
- Preston, C., Efstathiou, S., Campadelli-Fiume, G., Arvin, A., Mocarski, E. Ch 33. Human Herpesviruses Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Roizman, B., Whitley, R. J. An inquiry into the molecular basis of HSV latency and reactivation. Annu Rev Microbiol. 67, 355-374 (2013).
- Whitley, R., Kimberlin, . D. W., Prober, C. G., Arvin, A., et al. . Human Herpesviruses: Biology, Therapy, and Immunoprophylaxis. , (2007).
- Fueshko, S., Wray, S. LHRH cells migrate on peripherin fibers in embryonic olfactory explant cultures: an in vitro model for neurophilic neuronal migration. Dev Biol. 166 (1), 331-348 (1994).
- Parish, C. R. The role of heparan sulphate in inflammation. Nat Rev Immunol. 6 (9), 633-643 (2006).
- Zhang, X., Wang, B., Li, J. P. Implications of heparan sulfate and heparanase in neuroinflammation. Matrix Biol. 35, 174-181 (2014).
- Du, X., et al. Local GABAergic signaling within sensory ganglia controls peripheral nociceptive transmission. J Clin Invest. 127 (5), 1741-1756 (2017).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
