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Pesquisa do Câncer

O estabelecimento de um ensaio de colonização de pulmão para visualização de células de Tumor nos tecidos do pulmão de circulação

Published: June 16, 2018
doi:
10.3791/56761
, , , , , ,
1The Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine,National Cheng Kung University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine,National Cheng Kung University, 3Trauma Office,Children’s National Health System

Summary

Um modelo animal é necessário decifrar o papel de células tumorais (CTC) em promover a colonização de pulmão durante a metástase do cancro em circulação. Aqui, nós estabelecemos e realizou com sucesso um na vivo do ensaio para teste especificamente a exigência de assembly de fibronectina poliméricos (polyFN) na CTC para a colonização de pulmão.

Abstract

Metástase é a principal causa de morte por cancro. O papel da circulação de células tumorais (CTC) na promoção de metástases, em que colonização pulmonar por CTC criticamente contribui para primeiros processos de pulmão metastático, foi investigado vigorosamente. Como tal, os modelos animais são a única abordagem que capta o processo completo sistêmico de metástase. Dado que os problemas ocorrem em projetos experimentais anteriores para analisar as contribuições da CTC para extravasamento dos vasos sanguíneos, estabelecemos um ensaio de colonização de pulmão na vivo em que uma célula de longo-prazo-fluorescência-tracer, carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE), era usado para rotular células tumorais suspenso e perfusão pulmonar foi realizada para limpar não especìfica preso CTC antes da remoção do pulmão, imagem latente confocal e quantificação. Polimérica fibronectina (polyFN) montada em superfícies CTC foi encontrada para mediar a colonização de pulmão no estabelecimento final de tecidos de tumor metastático. Aqui, para testar especificamente o requisito de assembly polyFN no CTC para a colonização de pulmão e extravasamento, realizamos a curto prazo suspenso de ensaios de colonização pulmonar em que células de carcinoma de pulmão Lewis (LLCs) expressam estàvel FN-shRNA (shFN) ou scramble-shRNA (shScr) e pre-rotulado com 20 μM de CFSE por via intravenosa foram inoculadas em camundongos C57BL/6. Temos demonstrado com sucesso que as habilidades de shFN células LLC para colonizar os pulmões do mouse foram significativamente reduzidas em comparação com células de shScr LLC. Portanto, esta metodologia a curto prazo pode ser amplamente aplicada para demonstrar especificamente a capacidade do CTC dentro a circulação para colonizar os pulmões.

Introduction

Metástase é a principal causa de morte de câncer1,2. Células tumorais derivadas de tecidos primários entram a circulação em suspensão e sobrevivem vários desafios hematogênica, por exemplo, anoikis, imunes agressões e danos devido à tensão de cisalhamento de pressão arterial ou restrições geométricas, antes de serem capazes de colonizar órgãos distantes, um passo fundamental a ditar o sucesso de metástase3,4,5,6. Portanto, atualmente foram desenvolvidos esforços vigorosos na caracterização de células tumorais circulantes (CTC) e correlacionando estas características com a malignidade do tumor, metástase e as taxas de sobrevivência de câncer pacientes7,8 , 9. uma vez que o processo de metástase de câncer especificamente retrata um evento na vivo , modelos animais são a única abordagem que capta o processo completo sistêmico de metástase10,11,12 .

CTC-se tecidos de tumor metastático através de vários eventos celulares, incluindo a colonização de órgãos distantes1,2. No entanto, o mais comumente usado metástase ensaios13,14,15 não fornecem uma maneira de observar a colonização de CTC de órgãos distantes. Portanto, um projeto de ensaio na vivo para visualização de colonização do CTC é urgentemente necessária. Embora vários in vivo e ex vivo curto desvantagens, problemas e colonização de pulmão termo ensaios foram projetados permanecem. Por exemplo, enquanto a proteína fluorescência verde (GFP)-tumor superexpressão células têm sido utilizadas nestes ensaios22,23, leva tempo para estàvel transfect e clonar células tumorais com intensidade fluorescente GFP suficiente, sob o microscópio. Da mesma forma, embora transitória de coloração de células tumorais com o marcador de célula de longo prazo CFSE tem sido empregado para substituir as células do tumor-expressando GFP, continua a ser difícil julgar se as células do tumor CFSE-etiquetados são anexadas ou meramente presente dentro do vasculatura do extirpado órgãos distantes16,17.

Polimérica fibronectina (polyFN) montada em superfícies de CTC foi encontrada criticamente, contribuir para o estabelecimento de tumor metastático tecidos18,19,20,21,22 final . Aqui, realizamos a curto prazo pulmão ensaios de colonização na qual suspensos células de carcinoma de pulmão Lewis (LLCs) estàvel expressando FN-shRNA (shFN) ou scramble-shRNA (shScr) e pre-rotulado com CFSE por via intravenosa foram inoculados em camundongos C57BL/6. Após 2-3 dias, pulmões do mouse primeiro foram perfundidos com solução salina tamponada fosfato (PBS) para remover completamente o CTC solto dentro da vasculatura antes de serem submetidos a microscopia confocal e quantificação de pulmão-colonizar LLCs. Mostramos claramente que os números de pulmão-colonizar shFN LLCs e nódulos de tumor foram significativamente reduzidos em comparação com shScr LLCs, corroborando substancialmente o papel do assembly polyFN no CTC facilitar a colonização e crescimento do CTC na pulmões. Nosso estudo garante mais investigação para o papel de polyFN em metástase do cancro.

Protocol

Todas as experiências em ratos foram realizadas de acordo com as orientações do nosso Instituto (guia de cuidados e uso de animais de laboratório, NCKU Medical College). 1. preparação dos instrumentos, meios de cultura e pratos Antes de iniciar os protocolos experimentais, obter suturas cirúrgicas estéril, seringas de 1 mL com agulha 26G/0,5 cm (para injeção de veia cauda), seringas de 3 mL com agulha de 24G/cm 3 (para perfusão do pulmão), modificado águia Media (DMEM de…

Representative Results

Antes de realizar o ensaio de colonização de pulmão na vivo como ilustrado na figura 1A , para testar se polyFN em células tumorais suspenso Medeia colonização pulmonar e/ou extravasamento na facilitação de metástase, nós primeiro titulado diferentes concentrações de CFSE, um composto fluorescente que é a célula permeável e covalentemente conjuga intracelulares contendo amina moléculas26,<sup class="…

Discussion

Juntamente com longo prazo pulmonar colonização ensaios, a curto prazo, metodologia que utilizamos aqui para avaliar na vivo pulmonar colonização por CTC em órgãos distantes claramente revelada e diferenciado o papel específico de polyFN montado no CTC da colonização os pulmões, que em seguida levaram o extravasamento e processos metastáticos18,19,20,21. Apesar de rotulagem …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores desejam agradecer Dr. Chang Ming-Min e MS. Ya-Hsin Cheng pelo apoio técnico. Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia de Taiwan (a maioria-103-2325-B-006-009, a maioria-104-2325-B-006-001, a maioria-105-2325-B-006-001 e MOST-106-2320-B-006-068-MY3) e o Ministério da saúde e bem-estar (MOHW106-TDU-B-211-144004). Agradecemos também o apoio do laboratório de pesquisa do núcleo da faculdade de medicina, Universidade Nacional de Cheng Kung, seu microscópio confocal multi fóton.

Materials

Material
Bovine Serum Albumin (BSA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-9048-46-8
Bouin's Fluid MCC(medical chemical corporation)/POISON 456-A-1GL
CFSE Proliferation Dye ebiosciences 65-0850-85 Full name: Carboxyfluorescein succinimidyl ester
Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM)  (Gibco)ThermoFisher Scientific 12100-061
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-6381-92-6 For prepared trypsin-EDTA solution( Final concentration: 0.53mM ) 
Fetal bovine serum (FBS) (Gibco)ThermoFisher Scientific 10437-028
Lewis lung carcinoma (LLC) ATCC, Manassas, VA, USA CRL-1642
L-Glutamine, USP  (Gibco)ThermoFisher Scientific 21051-024
Potassium chloride (KCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7447-40-7 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 2.7mM )
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7778-77-0 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 1.8mM )
Sodium chloride (NaCl) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-7647-14-5 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 137mM )
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) Cyrusbioscience (Taipei, Taiwan) 101-10039-32-4 For prepared 1X PBS ( Final concentration: 10mM )
Trypan Blue Sigma Aldrich T6146 0.5 g mix with 100 mL 1X PBS
Trypsin Sigma Aldrich T4799 For prepared trypsin-EDTA solution ( Final concentration: 5g/L )
Zoletil 50 Virbac To dilute with 1X PBS 
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Compact Tabletop Centrifuge 2420 KUBOTA Co. 2420
Culture dish (6cm) Wuxi NEST Biotechnology Co. 705001
Disposable syringe (with needle) Perfect Medical Industry Co. 24G/3 cm;3 ml & 26G/0.5 cm;1 ml
End over end mixer C.T.I YOUNG CHENN TS-20 For suspended cells recovery 
FACSCalibur (FACS) BD biosciences
Forceps Dimeda 10.102.14
Forma Direct Heat CO2 incubator Thermo Fisher Scientific Inc. HEPA CLASS 100
Mouse restrainer (Cylindrical Restrainer 15-30 gm) Stoelting 51338
Multiphoton Confocal Microscope BX61WI Olympus FV1000MPE
Neubauer counting chamber Marienfeld-Superior 640010
Surgical scissor Dimeda 08.370.11
Surgical sutures  UNIK SURGICAL SUTURES MFG. CO. NO. 0034 Black Braided silk; non-absorbable (25YD; U.S.P. 4/0)
1.5 mL microcentrifuge tube Wuxi NEST Biotechnology Co. 615001
15 mL Greiner tube Greiner bio-one 188271
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Referências

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Lin, T., Liao, Y., Chang, W., Yang, C., Cheng, L., Cheng, M., Cheng, H. The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues. J. Vis. Exp. (136), e56761, doi:10.3791/56761 (2018).
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