Una quantitativa Dot Blot Assay AAV titolazione e suo uso per la valutazione funzionale di Virus Adeno-associato Assembly-attivazione proteine
Summary
Questo manoscritto dettagli un saggio di macchia semplice puntino per quantificazione dei titoli del virus adeno-associato (AAV) e la sua applicazione per studiare il ruolo dell’Assemblea-attivazione proteine (AAP), una nuova classe di proteine virali non strutturali, trovate tutte le AAV sierotipi, nel promuovere l’assemblaggio di capsidi derivato da sierotipi AAV cognati ed eterologi.
Abstract
Mentre virus adeno-associato (AAV) è ampiamente accettata come un vettore di attraente per la terapia genica, serve anche come un virus di modello per la comprensione della biologia del virus. Sotto questo aspetto, la recente scoperta di una proteina AAV non strutturali, chiamata proteina d’attivazione assembly (AAP), ha gettato nuova luce sui processi coinvolti nell’assemblaggio delle proteine del capside virale VP in un capside. Anche se molti sierotipi AAV richiedono AAP per assemblaggio, recentemente abbiamo riferito che AAV4, 5, e 11 sono eccezioni a questa regola. Inoltre, abbiamo dimostrato che AAPs e assemblati capsidi di diversi sierotipi di localizzano a diversi compartimenti subcellulari. Questa eterogeneità imprevista nella proprietà biologiche e ruoli funzionali di AAPs tra diversi AAV sierotipi sottolinea che l’importanza degli studi su AAPs derivata da diversi sierotipi. Un saggio di macchia semplice puntino per quantificazione AAV e la sua applicazione per valutare la specificità di dipendenza e sierotipo AAP nell’assembly del capsid i dettagli di questo manoscritto. Per dimostrare l’utilità di questo test di dot blot, abbiamo precisato per caratterizzare capside assembly e AAP dipendenza di serpente AAV, un rettile precedentemente atipico AAV, così come AAV5 e AAV9, che precedentemente sono stati indicati per essere indipendente dalla AAP e AAP-dipendente sierotipi, rispettivamente. L’analisi ha rivelato che il serpente AAV capside assembly richiede serpente AAP e non può essere promosso da AAPs da AAV5 e AAV9. L’analisi inoltre ha mostrato che, a differenza di molti il comune sierotipo AAPs che promuovere l’Assemblea del capside eterologo da cross-complementazione, serpente AAP non promuovere l’Assemblea di capsidi AAV9. Inoltre, ci mostra che la scelta di nucleasi influisce in modo significativo la lettura del test dot blot, e così, scegliendo un enzima ottimo è fondamentale per una valutazione positiva dei titoli di AAV.
Introduction
Virus adeno-associato (AAV) è un virus a DNA piccolo, senza involucro, a singolo filamento con un genoma di circa 4,7 kilobasi (kb). Il genoma AAV contiene Apri-reading frame (ORF) per i geni rep e cap . Nel 2010, una precedentemente non identificata nonstructural proteina codificata da un ORF + 1 telaio-spostato all’interno del gene di tappo AAV2 fu scoperto da Sonntag et al e trovata a giocare un ruolo critico nell’assemblaggio di proteine monomeriche AAV2 del capside VP in un virale capside1. Questa nuova proteina è stata nominata proteina d’attivazione assembly (AAP) dopo il suo ruolo nella promozione del capsid assemblaggio1.
ORFs per AAP sono stati identificati bioinformatically nel genoma dei tutti i parvovirus del genere Dependoparvovirus, ma non all’interno del genoma dei virus dei diversi generi del parvovirus famiglia1,2. Studi funzionali di questa proteina romanzo erano inizialmente concentrati sull’AAP dal prototipo AAV2 (AAP2), che ha istituito il ruolo essenziale della AAP2 nel targeting completamente smontate proteine VP per il nucleolo per il loro accumulo e la formazione in assemblati capsidi1,3,4. L’incapacità dei capsidi AAV2 di assemblare in assenza di espressione di AAP è stato indipendentemente confermato da più gruppi, compreso il nostro1,2,3,4,5 . Studi successivi su sierotipi AAV 1, 8 e 9 ha confermato il ruolo critico di AAPs nell’assembly del capsid, come proteine monomeriche VP3 di AAV1, 8, e 9 erano in grado di formare un capside completamente assemblato in assenza di co-espressione di AAP2.
Recentemente, attraverso approcci che includono l’uso di quantitativi dot blot analisi, abbiamo studiato la capacità di AAV1 di 12 VP3 monomeri per assemblare in capsidi in assenza di espressione di AAP e la capacità di AAP1 al 12 di promuovere l’Assemblea del VP3 monomeri da sierotipi eterologi. Questo studio ha rivelato che AAV4, 5 e 11 VP3 monomeri possono montare senza AAP. Inoltre, è stato trovato che otto dei dodici sierotipi AAP abbiamo esaminato (cioè, tutti, ma AAP4, 5, 11 e 12) visualizzata una vasta capacità di supportare Assembleia capside eterologhe capsidi di sierotipo AAV, mentre AAP4, 5, 11 e 12 visualizzato un sostanzialmente capacità limitata a questo proposito6. Questi quattro sierotipi sono filogeneticamente distanti dagli altri AAP sierotipi2,3. Inoltre, lo studio ha scoperto significativa eterogeneità nelle localizzazioni subcellulari di diversi AAPs6. Inoltre, lo studio ha suggerito che la stretta associazione di AAP con capsidi assemblati e il nucleolo, il segno distintivo dell’Assemblea di capside AAV2, necessariamente non può essere estesa ad altri sierotipi inclusi AAV5, 8 e 9, che visualizzano nucleolar esclusione di capsidi assemblato6. Così, le informazioni ottenute dallo studio di qualsiasi particolare sierotipo AAP non sono ampiamente applicabile a tutti i biologia AAP. Tale natura sconcertante della biologia AAP sottolinea la necessità di indagare il ruolo e la funzione di ogni AAP da sierotipi AAV sia canonici e non canoniche.
Il ruolo biologico di AAP nell’assembly capside può essere valutato determinando che i titoli di particella virale AAV completamente confezionato prodotta in cellule embrionali umane del rene (HEK) 293 cellule, la linea cellulare più comunemente utilizzati per la produzione di vettore AAV, con o senza proteine AAP espressione. I metodi standard per la quantificazione di AAV sono PCR quantitativa (qPCR)-base saggi7,8 e quantitativa dot blot-based assays9. Altri metodi per la quantificazione della particella virale AAV come analisi enzima-collegata dell’immunosorbente10,11 o densità ottica misura12 non sono ideali per campioni o campioni provenienti da molti diversi sierotipi di AAV contaminata da impurità (lisati grezza o terreni di coltura), che sono spesso i campioni utilizzati per la ricerca AAV. Attualmente, qPCR è più ampiamente usato per la quantificazione dell’AAV; Tuttavia, è necessario riconoscere potenziali avvertimenti del dosaggio qPCR-basato, come l’analisi possono provocare errori sistemici e significativo titolo variazioni13,14. Analisi PCR-based sono interessate da una serie di fattori, quali la presenza di forcine covalentemente chiusi terminale nei modelli di PCR che inibiscono amplificazione13potenzialmente di confusione. Anche un individuo esperto può introdurre potenziali fattori di confondimento in una base di qPCR inconsapevolmente dosaggio13. Al contrario, analisi di quantitativi dot blot sono una tecnica di biologia molecolare classica che non riguarda l’amplificazione del genoma e utilizza un principio molto semplice con un rischio minimo di errori rispetto alle analisi qPCR-based. Il metodo è meno tecnicamente impegnativi; di conseguenza, i risultati del saggio sono ragionevolmente riproducibili anche da individui inesperti.
In questo rapporto, descriviamo i dettagli metodologici di analisi quantitativa dot macchia usiamo ordinariamente per quantificazione di vettore AAV e fornire un esempio di come applicare il dosaggio per studiare il ruolo di promozione di assemblaggio di AAPs in comune con sierotipi (AAV5 e AAV9) e un’ in precedenza atipici AAP dal serpente AAV14. In natura, AAV VP e proteine AAP sono espressi in cis da un singolo gene (cioè, VP-AAP cis-complementazione), mentre nel test qui descritto, proteine VP e AAP sono fornite in trans da due plasmidi separati (cioè, VP-AAP Trans-complementazione). Poiché ogni proteina VP o AAP da sierotipi diversi può essere espressa da ogni plasmide indipendente, diventa possibile testare eterologa VP-AAP combinazioni di assemblaggio del capside (cioè, VP-AAP cross-complementazione). Brevemente, AAV VP3 da vari sierotipi è espresso in cellule HEK 293 di transfezione del DNA del plasmide per assemblare un genoma di vettore AAV in presenza o assenza del sierotipo cognato AAP, o in presenza di un sierotipo eterologo AAP. A seguito di produzione, terreni di coltura e lisati cellulari sono sottoposti ad un’analisi della macchia di dot per quantificare il genoma virale all’interno della shell di capside. Il primo passo del dot blot test è quello di trattare i campioni con una nucleasi per rimuovere contaminanti plasmide DNAs e non imballati AAV genomi in campioni. In caso contrario aumenterebbe i segnali di sfondo in particolare quando non purificata i campioni sono analizzati. Ciò allora è seguita da un trattamento con proteasi per rompere capsidi virali e rilasciare nucleasi-resistente genomi virali in soluzioni campione. Genomi virali, prossimi sono denaturati, cancellati su una membrana e ibridati con una sonda di DNA specifico del genoma virale per quantificazione. Con il test di esempio segnalato qui, dimostriamo che serpente AAV VP3 richiede serpente AAP per l’assemblaggio del capside e che serpente AAP non promuovere l’Assemblea del AAV9 capsidi a differenza di molti di AAPs derivato da sierotipi di AAP-dipendente che possono anche promuovere l’Assemblea del capsidi sierotipo eterologa. Infine, segnaliamo un avvertimento importante per qPCR o quantificazione di dot blot-based AAV saggi che la scelta di nucleasi influenza in modo significativo i risultati del saggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo rapporto, l’utilità di analisi blot quantitativo dot per studiare AAV AAPs e il loro ruolo nell’assembly del capsid è descritto. Conoscenze acquisite da questi studi possono fornire approfondimenti dettagliati nelle differenze innate nel processo di assemblaggio del capside AAV ed il ruolo funzionale di AAPs tra diversi sierotipi. A questo proposito, il punto croce-complementazione AAV VP3-AAP blot analisi ha rivelato che serpente AAV VP3 visualizzato una rigorosa dipendenza il co-espressione di sue cognate A…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ringraziamo di averci fornito il plasmide pEMBL-CMV-GFP Xiao Xiao presso la University of North Carolina a Chapel Hill. Ringraziamo Christopher Cheng e Samuel J. Huang per una lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato dal servizio di sanità pubblica concede (NIH R01 NS088399 e T32 EY232113).
Materials
| Benzonase | MilliporeSigma | 1016970001 | Referred to as Serratia marcescen endonuclease in the main text. |
| DNase I | Roche | 4716728001 | Referred to as DNase I Enzyme A in the main text. |
| DNase I | Invitrogen | 18047019 | Referred to as DNase I Enzyme B in the main text. |
| DNase I | New England Biolabs | M0303L | Referred to as DNase I Enzyme C in the main text. |
| 1.5 mL Attached O-Ring Screw Cap Microcentrifuge Tubes | Corning | 430909 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 352097 | |
| 3 M Sodium Acetate | Teknova | S0298 | |
| 50 mL Polypropylene Conical Tube | Corning | 430291 | |
| AAV-293 Cells | Agilent | 240073 | HEK-293 cell line optimized for the packaging of AAV virions. |
| AccuGENE 0.5 M EDTA Solution | Lonza | 51234 | |
| AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8.0 | Lonza | 51238 | |
| AccuGENE 10% SDS | Lonza | 51213 | |
| AccuGENE 1X TE Buffer | Lonza | 51235 | |
| Bio-Dot Apparatus | Bio-Rad | 1706545 | |
| Bovine Serum Albumin | MilliporeSigma | A3294 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Chloroform | MilliporeSigma | 372978 | |
| DNA Extractor Kit | Wako Pure Chemical Industries | 295-50201 | This is used for quantitative dot blots on purified virus. We use only a half volume of all the reagents in each step recommended for the Protocol Scheme 2 in the manual provided by the manufacturer. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)-high glucose (4.5 g/L) | Lonza | 12-614F | |
| ElectroMAX DH10B Cells | Thermo Fisher Scientific | 18290015 | |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs | 2716 | |
| Fetal Bovine Serum | VWR | 1500-500 | |
| Ficoll 400 | Alfa Aesar | B22095 | Referred to as Polysucrose 400. |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | Axiovert 40 CFL | |
| Glycogen | Roche | 10901393001 | |
| Herring Sperm DNA | Invitrogen | 15634-017 | |
| Hybridization Tubes | Thermo Fisher Scientific | 13-247-150 | |
| ImageQuant TL | GE Healthcare Life Sciences | ImageQuant TL | |
| L-glutamine 200 mM | Lonza | 17-605E | |
| Magnesium Choloride Hexahydrate | MilliporeSigma | M0250 | |
| MicroPulser Electroporator | Bio-Rad | 1652100 | |
| Mini Quick Spin DNA Columns | MilliporeSigma | 11814419001 | |
| pAAV-RC2 Vector | Cell Biolabs Inc | VPK-422 | |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | |
| Phosphate Buffered Saline | Lonza | 17-516F | |
| Phosphorimaging Exposure Cassette | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Phosphorimaging Screen | GE Healthcare Life Sciences | Various | |
| Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12162 | |
| Platinum Pfx DNA Polymerase | Invitrogen | 11708013 | |
| Polyethylenimine | Polysciences Inc | 23966-2 | |
| Polyvinylpyrrolidone | MilliporeSigma | P5288 | |
| Prime-It II Random Primer Labeling Kit | Agilent Technologies | 300385 | |
| Primer AAP Forward (N25 nucleotides from the 4th nucleotide in the AAP ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAA-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer AAP Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Forward (N25 the first 25 nucleotides of the VP3 ORF, RE1 is a restriction enzyme site for cloning): CTAA-RE1-CACC-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Primer VP3 Reverse (N25 is the last 25 nucleotides of the AAP ORF, RE2 is a restriction enzyme site for cloning): TCTT-RE2-N25 | MilliporeSigma | Custom Primer | |
| Proteinase K Solution | Invitrogen | 25530-049 | |
| Restriction Enzymes | New England Biolabs | Various | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | 15632011 | |
| Serological Pipettes | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11 | |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-10 | |
| Sodium Citrate Tribasic Dihydrate | MilliporeSigma | C8532 | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203L | |
| Thermal Cycler | Eppendorf | 6321000515 | |
| Tissue-culture Treated 6-well Plate | Corning | 353046 | |
| Tris Base | Thermo Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Typhoon FLA 7000 | GE Healthcare Life Sciences | 28955809 | |
| UltraPure Buffer-Saturated Phenol | Invitrogen | 15513-047 | |
| UV Crosslinker | Spectroline | XLE-1000 | Optimal Crosslink mode is used, providing a UV energy dosage of 120 mJ/cm2. |
| Zeta-Probe Membrane | Bio-Rad | 162-0165 |
Referências
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