Estabelecimento de uma cultura primária de Sarcoma macio do tecido derivado de paciente
Summary
O seguinte protocolo incide sobre o estabelecimento de uma cultura primária de sarcoma de tecidos moles paciente-derivado (STS). Este modelo pode nos ajudar a compreender melhor o fundo molecular e perfil farmacológico destas malignidades raras e poderia representar um ponto de partida para novas pesquisas que visam melhorar a gestão do STS.
Abstract
Sarcomas de partes moles (STS) representam um espectro de malignidades heterogêneos com difícil diagnóstico, classificação e de gestão. Até à data, foram identificados mais de 50 subtipos histológicos destes raros tumores sólidos. Assim, devido à sua extraordinária diversidade e baixa incidência, nossa compreensão da biologia desses tumores é ainda limitado. Paciente-derivado de culturas representam a plataforma ideal para estudar farmacologia e fisiopatologia do STS. Assim, desenvolvemos um modelo humano pré-clínicos de STS a partir de amostras de tumor colhidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica. Culturas de células do paciente-derivado STS foram obtidas a partir dos espécimes cirúrgicos por digestão de colagenase e isoladas por filtração. As células foram contadas, semeadas e deixou por 14 dias em culturas padrão monocamada e processadas por análise a jusante. Antes de executar análises moleculares ou farmacêuticas, o estabelecimento de culturas primárias de STS foi confirmado através da avaliação das características de cytomorphologic e, quando disponível, marcadores imuno-histoquímicos. Este método representa uma ferramenta útil 1) para estudar a história natural destas malignidades mal exploradas e 2) para testar os efeitos de diferentes drogas em um esforço para aprender mais sobre seus mecanismos de ação.
Introduction
Sarcomas de partes moles (STS) incluem um espectro de lesões heterogêneas de contabilidade de origem mesenquimal para 1% de todos os tumores sólidos1,2, e a nova classificação da Organização Mundial de saúde reconhece a presença de mais de 50 Subtipos diferentes3. Entre estes, os histotypes mais comuns são sarcoma de adipócitos ou Lipossarcoma e Leiomiossarcoma, representando 15% e 11% de todos os adultos STS, respectivamente de4,5. Embora o STS podem desenvolver em diferentes partes do corpo, as extremidades e retroperitoneal são os locais mais comuns, ocorrendo em 60% e 20% dos casos, respectivamente6.
A pedra angular da terapia para doença localizada é a ressecção cirúrgica ampla, Considerando que os benefícios da quimioterapia adjuvante e neoadjuvante não são ainda claras e são considerados apenas em casos selecionados7. Na configuração da metastática, quimioterapia é o tratamento padrão, mas mostra resultados limitados8. Uma melhor compreensão da biologia molecular da STS contribuiria para melhorar o diagnóstico atual, otimizar os tratamentos disponíveis e identificar novos alvos para a terapia.
Dentro deste contexto, foi realizada pesquisa em câncer por muitos anos usando linhas de célula imortalizado9. Esses modelos experimentais são normalmente cultivados em monocamada padrão suporta ou implantados em imunodeficientes roedores estabelecer na vivo xenoenxertos modelos10. Linha celular imortalizado representa um gerenciável e fácil-para-loja material com o qual um amplo número de experimentos de pesquisa pode ser realizado. Eles são, na verdade, os menos dispendiosos e mais amplamente utilizado a ferramenta em estudos pré-clínicos11.
No entanto, célula-linha com base em modelos de câncer também têm algumas limitações, por exemplo, prolongada de cultura em um sistema de monocamada juntamente com um número crescente de passagens induz fenotípica e deriva genética, fazendo as células menos provável para recapitular o tumor chave características. Além disso, culturas de células linha deixam de reproduzir a interação célula a célula e sinalização diafonia molécula que imitam o comportamento biológico dos tumores e caracterizar o microambiente do tumor. Estas questões formam a base do fosso existente entre os resultados clínicos e pré-clínicos12.
Dado o acima, o interesse no paciente-derivado de culturas primárias aumentou13. Com efeito, a excisão do tecido normal e maligno reduz o risco de perder o fenótipo de células de câncer e heterogeneidade, oferecendo assim uma matéria-prima que é o mais representativo do microambiente do tumor. Além disso, o uso de amostras de tumor frescas colhidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica nos permite investigar tumores única e comparar diferentes lesões da mesma parte do corpo de14 um paciente. Pelas razões acima expostas, culturas de células derivadas de tecido proporcionam um valioso material para estudar o tumor fisiopatologia e farmacologia15,16,17, especialmente no STS em quais linhas de células de sarcoma comercialmente disponível são limitados,18. Nós aperfeiçoamos, portanto, um método para estabelecer uma paciente-derivado STS cultura de célula primária a partir de2019,13,do tecido tumor cirurgicamente extirpado. Nosso método consiste em desagregar o espécime de tumor em pequenos fragmentos de tecido seguidos de dissociação de tecido enzimática durante a noite para obter uma suspensão de célula única. No dia seguinte, a digestão enzimática é interrompido pela adição de meio de cultura fresco e a suspensão obtida é filtrada para remover fragmentos de tecido, célula-agregados e material de matriz em excesso ou detritos. Finalmente, uma fração de células tumorais isoladas é cytospinned em lâminas de vidro, fixo e armazenados para jusante análise visado confirmando o estabelecimento da cultura primária de STS por cytomorphological, imuno-histoquímica e avaliação citogenética molecular (por exemplo, análise de peixe de MDM2 amplificação representa o padrão diagnóstico diferencial para uma Lipossarcoma bem diferenciada e a condrossarcoma Lipossarcoma) 4. as células restantes são semeadas em uma cultura padrão monocamada para estudos farmacológicos e de criação de perfil de expressão genética. Todos os experimentos são realizados usando baixa passagem culturas primárias para evitar a seleção dos subclones de câncer específicos e analisaram por um patologista experiente sarcoma. Assim, criamos um humano totalmente STS ex-vivo modelo13,19,20. Esta altamente versátil, fácil de punho modelo poderia representar uma ferramenta útil para diferentes tipos de pesquisa pré-clínica, por exemplo, para identificar novos marcadores moleculares para diagnóstico e prognóstico ou para ganhar uma compreensão mais profunda da atividade e mecanismos de ação de padrão e novos fármacos utilizados na gestão do STS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos pré-clínicos bem definidos são necessários para elucidar o fundo molecular de tumores, prever o prognóstico pobre e desenvolver novas estratégias terapêuticas para pacientes com câncer. Isto é especialmente importante para tumores raros como STS cuja alta heterogeneidade em termos de morfologia, comportamento agressivo em potencial e clínico desafia nossa compreensão da biologia do STS e gestão paciente21. Além disso, poucas linhas celulares sarcoma comerciais disponíveis lim…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer Gráinne Tierney assistência editorial.
Materials
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
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