Inrättandet av en primär kultur av patientderiverade mjukdelssarkom
Summary
Följande protokoll är inriktad på inrättande av en primär kultur av patientderiverade mjukdelssarkom (STS). Denna modell kunde hjälpa oss att bättre förstå de molekylära bakgrunden och farmakologiska profilen av dessa sällsynta maligniteter och skulle kunna utgöra en utgångspunkt för vidare forskning som syftar till att förbättra STS management.
Abstract
Mjukdelssarkom (STS) representerar ett spektrum av heterogena maligniteter med en svår diagnos, klassificering och hantering. Hittills har har mer än 50 histologiska subtyper av dessa sällsynta solida tumörer identifierats. Således, på grund av sin extraordinära mångfald och låg incidens, vår förståelse av biologi av dessa tumörer är fortfarande begränsad. Patientderiverade kulturer utgör den idealiska plattformen att studera STS patofysiologi och farmakologi. Vi således framkallade en human preklinisk modell av STS start från tumör prover skördas från patienter som genomgår kirurgisk resektion. Patientderiverade STS cellkulturer var erhållits från kirurgiska exemplaren av kollagenas matsmältning och isoleras genom filtrering. Cellerna var räknade, seedade, och kvar i 14 dagar i standard enskiktslager kulturer och sedan bearbetas av nedströms analys. Innan du utför molekylär eller farmaceutiska analyser, inrättandet av STS primära kulturer bekräftades genom utvärderingen av cytomorphologic funktioner och, om tillgängligt, immunhistokemiska markörer. Denna metod representerar ett användbart verktyg (1) för att studera den naturliga historien om dessa dåligt utforskade maligniteter och 2) att testa effekterna av olika droger i ett försök att lära dig mer om deras verkningsmekanismer.
Introduction
Mjukdelssarkom (STS) inkluderar ett spektrum av heterogena lesioner av mesenkymala ursprung står för 1 procent av alla solida tumörer1,2, och den nya WHO-klassifikationen erkänner förekomsten av mer än 50 olika subtyper3. Bland dessa är de vanligaste histotypes fettceller sarkom eller liposarcoma och leiomyosarkom, står för 15% och 11% av alla vuxna STS, respektive4,5. Även om STS kan utvecklas i olika delar av kroppen, är extremiteter och retroperitoneum de vanligaste platser, som förekommer i 60% och 20% av fallen, respektive6.
Hörnstenen i behandling för lokaliserad sjukdom är bred kirurgisk resektion, medan fördelarna med adjuvant och neoadjuvant kemoterapi är fortfarande oklart och anses endast i utvalda fall7. I inställningen för metastaserande kemoterapi är vårdstandard men visar begränsade resultat8. En bättre förståelse för molekylärbiologi av STS skulle bidra till att förbättra nuvarande differentialdiagnos, optimera de tillgängliga behandlingarna och identifiera nya mål för behandling.
I detta sammanhang har forskning om cancer utförts under många år använder förevigade cell linjer9. Dessa experimentella modeller är normalt odlade i standard enskiktslager stöder eller implanteras i nedsatt immunförsvar gnagare att upprätta i vivo xenograft-modeller10. Förevigade cellinjer representerar ett lätthanterligt och lätt-to-store material som ett stort antal forskningsexperiment kan utföras. De är, i själva verket det billigaste och mest använda verktyget i prekliniska studier11.
Dock cell-linje baserat cancer modeller har också vissa begränsningar, t.ex. långvarig kultur i en enskiktslager system tillsammans med ett ökande antal passager inducerar fenotypisk och genetisk drift, göra celler mindre sannolikt för att recapitulate nyckel tumör funktioner. Dessutom misslyckas cellkulturer linje att reproducera cell till cell i samspelet och signalering molekyl överhörning som efterliknar den biologiska beteenden av tumörer och karaktärisera den tumör mikromiljö. Dessa frågor utgör grunden för klyftan mellan prekliniska och kliniska resultat12.
Mot bakgrund av har intresset för patientderiverade primära kulturer ökat13. Faktiskt minskar excision av malign och normal vävnad risken att förlora cancer cell fenotyp och heterogenitet, erbjuder därmed utgångsmaterial som är mer representativ för den tumör mikromiljö. Dessutom kan användningen av färsk tumör prover skördas från patienter som genomgår kirurgisk resektion oss att undersöka enda tumörer och jämföra olika lesioner från samma del av en patients kropp14. Av ovanstående skäl ge vävnad-derived cellkulturer ett värdefullt material för att studera tumören patofysiologi och farmakologi15,16,17, särskilt i STS i cellinjer som kommersiellt tillgängliga sarkom är begränsad18. Vi har därmed optimerat en metod för att upprätta en patientderiverade STS primära cellkultur start från kirurgiskt exciderad tumör vävnad13,19,20. Vår metod består av upphöra tumör preparatet i små vävnad fragment följt av övernattning enzymatisk vävnad dissociation att erhålla en enda cellsuspension. Följande dag, enzymatisk nedbrytning stoppas genom att lägga till färska kultur media och erhållna suspensionen filtreras för att ta bort vävnad fragment, cell-aggregat, och överskott matrismaterial eller skräp. Slutligen, en bråkdel av isolerade tumörceller är cytospinned på objektglas, fast och lagras för efterföljande analys syftar till att bekräfta inrättandet av STS primära kultur av cytomorphological, immunhistokemiska och molekylär cytogenetiska utvärdering (t.ex. fisk analys av MDM2 förstärkning representerar standard differentialdiagnos för en väl differentierad liposarcoma och den dedifferentiated liposarcoma) 4. återstående cellerna är seedade i en standard enskiktslager kultur för gen uttryck profilering och farmakologiska studier. Alla experimenten utförs med låg passage primära kulturer att undvika urvalet av specifika cancer subkloner och analyseras av en erfaren sarkom patolog. Därmed har vi skapat en helt human STS ex-vivo modell13,19,20. Denna mycket mångsidig, lätt att handtag modell skulle kunna utgöra ett användbart verktyg för olika typer av preklinisk forskning, t.ex. att identifiera nya molekylära markörer för diagnos och prognos eller för att få en djupare förståelse av verksamheten och verkningsmekanismer åtgärd av standard och nya läkemedel som används i hanteringen av STS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Väldefinierade prekliniska modeller behövs för att klarlägga molekylära bakgrunden av tumörer, förutsäga dålig prognos och utveckla nya terapeutiska strategier för cancerpatienter. Detta är särskilt viktigt för sällsynta tumörer som STS vars höga heterogenitet vad gäller morfologi, aggressiv potential, och kliniska beteende utmanar vår förståelse av STS biologi och patienthantering21. Dessutom begränsar de kommersiella sarkom cell raderna tillgängliga prekliniska undersöknin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Gráinne Tierney för redaktionellt stöd.
Materials
| DMEM High Glucose | EuroClone | ECB7501L | |
| Fetal bovine serum | EuroClone | ECS0180D | |
| Glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Paraformaldehyde 4% aqueous solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 157-4-100 | |
| Penicillin streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Triazol reagent | Ambion Life-Technologies | 15596018 | |
| Trypsin | EuroClone | ECB3052D |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
- Linch, M., Miah, A. B., Thway, K., Judson, I. R., Benson, C. Systemic treatment of soft-tissue sarcoma gold standard and novel therapies. Nat Rev Clin Oncol. 11 (4), 187-202 (2014).
- Fletcher, C. D. The evolving classification of soft tissue tumours – an update based on the new 2013 WHO classification. Histopathology. 64 (1), 2-11 (2014).
- De Vita, A., et al. Current classification, treatment options, and new perspectives in the management of adipocytic sarcomas. Onco Targets Ther. 9 (12), 6233-6246 (2016).
- Recine, F., et al. Update on the role of trabectedin in the treatment of intractable soft tissue sarcomas. Onco Targets Ther. 10, 1155-1164 (2017).
- Ducimetière, F., et al. Incidence of sarcoma histotypes and molecular subtypes in a prospective epidemiological study with central pathology review and molecular testing. PLoS One. 6 (8), 20294 (2011).
- Nussbaum, D. P., et al. Preoperative or postoperative radiotherapy versus surgery alone for retroperitoneal sarcoma: a case-control, propensity score-matched analysis of a nationwide clinical oncology database. Lancet Oncol. 17 (7), 966-975 (2016).
- The ESMO/European Sarcoma Network Working Group. Soft tissue and visceral sarcomas: ESMO clinical practice guidelines for diagnosis, treatment and follow-up. Ann Oncol. 25, 102-112 (2014).
- Paul, J. The Cancer Cell in Vitro: A Review. Pesquisa do Câncer. 22, 431-440 (1962).
- Morton, C. L., Houghton, P. J. Establishment of human tumor xenografts in immunodeficient mice. Nat Protoc. 2 (2), 247-250 (2007).
- Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
- Vannucci, L. Stroma as an Active Player in the Development of the Tumor Microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (3), 159-166 (2015).
- De Vita, A., et al. Activity of Eribulin in a Primary Culture of Well-Differentiated/Dedifferentiated Adipocytic Sarcoma. Molecules. 3 (12), 1662 (2016).
- Failli, A., et al. The challenge of culturing human colorectal tumor cells: establishment of a cell culture model by the comparison of different methodological approaches. Tumori. 95 (3), 343-347 (2009).
- Steinstraesser, L., et al. Establishment of a primary human sarcoma model in athymic nude mice. Hum. Cell. 23, 50-57 (2010).
- Raouf, A., Sun, Y. J. In vitro methods to culture primary human breast epithelial cells. Methods Mol. Biol. 946, 363-381 (2013).
- Daigeler, A. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29, 313 (2008).
- Pan, X., Yoshida, A., Kawai, A., Kondo, T. Current status of publicly available sarcoma cell lines for use in proteomic studies. Expert Rev Proteomics. 13 (2), 227-240 (2016).
- Liverani, C., et al. Innovative approaches to establish and characterize primary cultures: an ex vivo. 3D system and the zebrafish model. Biol Open. 15 (2), 309 (2017).
- De Vita, A., et al. Myxofibrosarcoma primary cultures: molecular and pharmacological profile. Ther Adv Med Oncol. 9 (12), 755-767 (2017).
- Blay, J. Y., Ray-Coquard, I. Sarcoma in 2016: Evolving biological understanding and treatment of sarcomas. Nat Rev Clin Oncol. 14 (2), 78-80 (2017).
- Dairkee, S. H., Deng, G., Stampfer, M. R., Waldman, F. M., Smith, H. S. Selective cell culture of primary breast carcinoma. Cancer Res. 55 (12), 2516-2519 (1995).
- Kar, R., Sharma, C., Sen, S., Jain, S. K., Gupta, S. D., Singh, N. Response of primary culture of human ovarian cancer cells to chemotherapy: In vitro individualized therapy. J Cancer Res Ther. 12 (2), 1050-1055 (2016).
- Ravi, A., et al. Proliferation and Tumorigenesis of a Murine Sarcoma Cell Line in the Absence of DICER1. Cancer Cell. 21 (6), 848-855 (2012).
- Zhong, X. Y., et al. Effect of vegf gene knockdown on growth of the murine sarcoma cell line MS-K. Cells. 16 (6), 625-638 (2011).
- Kidani, T., Yasuda, R., Miyawaki, J., Oshima, Y., Miura, H., Masuno, H. Bisphenol A Inhibits Cell Proliferation and Reduces the Motile Potential of Murine LM8 Osteosarcoma Cells. Anticancer Res. 37 (4), 1711-1722 (2017).
- Sugiyasu, K., et al. Radio-sensitization of the murine osteosarcoma cell line LM8 with parthenolide, a naturalinhibitor of NF-κB. Oncol Lett. 2 (3), 407-412 (2011).
- Daigeler, A., et al. Heterogeneous in vitro effects of doxorubicin on gene expression in primary human liposarcoma cultures. BMC Cancer. 29 (8), 313 (2008).
