सेरेब्रल organoids इन विट्रो मेंजल्दी मानव मस्तिष्क विकास की जांच करने के लिए एक नया मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस अनुच्छेद के लिए कुशलतापूर्वक महत्वपूर्ण लक्षण वर्णन और मांयता कदम सहित मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं से सजातीय पृष्ठीय forebrain-प्रकार organoids उत्पंन करने के लिए विस्तृत पद्धति प्रदान करता है ।
मानव प्रांतस्था अत्यधिक विस्तार किया है और विशिष्ट कार्यात्मक क्षेत्रों के साथ एक जटिल संरचना दर्शाती है, उच्च मस्तिष्क समारोह प्रदान, अनुभूति के रूप में । मानव मस्तिष्क प्रांतस्था विकास के अध्ययन के प्रयास मॉडल प्रणालियों की उपलब्धता के द्वारा सीमित कर दिया गया है । मानव प्रणाली के लिए कुतर अध्ययनों से परिणाम का अनुवाद प्रजातियों के अंतर से प्रतिबंधित है और मानव प्राथमिक ऊतकों पर अध्ययन ऊतक की उपलब्धता की कमी के साथ ही नैतिक चिंताओं में बाधा उत्पन्न कर रहे हैं । मानव pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) प्रौद्योगिकी में हाल के विकास के तीन आयामी (3 डी) आत्म आयोजन organotypic संस्कृति प्रणाली है, जो एक निश्चित सीमा तक मानव-विशिष्ट विट्रो मेंमस्तिष्क विकास के लिए नकल की पीढ़ी में शामिल हैं । वर्तमान में, विभिंन प्रोटोकॉल या तो पूरे मस्तिष्क या मस्तिष्क क्षेत्र विशिष्ट organoids की पीढ़ी के लिए उपलब्ध हैं । सजातीय और प्रतिलिपि forebrain की पीढ़ी के लिए विधि-प्रेरित पीएससी (iPSC), जो हम पहले से स्थापित है और यहां का वर्णन से organoids प्रकार पीएससी की आंतरिक क्षमता को जोड़ती है के प्रति निर्देशित विभेद के साथ स्वयं को संगठित पूर्वकाल neuroectodermal वंश और मैट्रिक्स embedding एक सतत neuroepithelium के गठन का समर्थन करने के लिए । अधिक विशेष रूप से, इस प्रोटोकॉल शामिल है: (1) iPSC समुच्चय की पीढ़ी, एक धाराप्रवाह monolayer संस्कृति के लिए iPSC कालोनियों के रूपांतरण सहित; (2) पूर्वकाल neuroectoderm की प्रेरण; (3) एक मैट्रिक्स पाड़ में neuroectodermal समुच्चय की embedding; (४) neuroectodermal समुच्चय से forebrain-प्रकार organoids की पीढ़ी; और (५) forebrain-प्रकार के organoids का निर्धारण और सत्यापन. जैसे, इस प्रोटोकॉल मानकीकृत और प्रतिलिपि iPSC की पीढ़ी के लिए एक आसानी से लागू प्रणाली प्रदान करता है-व्युत्पंन cortical ऊतक संरचनाओं में।
मानव मस्तिष्क स्पष्ट रूप से सबसे जटिल अंगों में से एक है और सभी मानव बौद्धिक क्षमताओं के लिए जिंमेदार है । इस प्रकार, मानव की एक गहरी समझ विशेष मस्तिष्क विकास मानव संज्ञानात्मक क्षमताओं की समझ के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त है । परंपरागत रूप से, ट्रांसजेनिक पशुओं के मस्तिष्क के विकास का अध्ययन करने के लिए मॉडल जीवों के रूप में सेवा की । इन मॉडलों मस्तिष्क विकास के सिद्धांतों में मौलिक अंतर्दृष्टि प्रदान की है । अब हम जानते है कि सभी स्तनधारियों में मस्तिष्क के विकास की एक आम सुविधा जनक प्रसार, neurogenesis, और ंयूरॉंस प्रवास की एक सटीक कोरियोग्राफी है । वहां रहे हैं, तथापि, मॉडल जीवों के दिमाग के बीच महत्वपूर्ण संरचनात्मक मतभेद, ऐसे कुतर और मनुष्यों के रूप में, विशेष रूप से neocortex में । प्राथमिक तंत्र है कि रहनुमा cortical विकास के लिए योगदान करने का प्रस्ताव किया गया है स्टेम और जनक कोशिकाओं के साथ ही बाहरी रेडियल glia कोशिकाओं (oRGCs) है, जो केवल बहुत ही कम कुतर में पाया जाता है की पीढ़ी के एक वृद्धि प्रसार कर रहे है1 ,2,3.
मॉडल मानव मस्तिष्क प्रांतस्था विकास के तरीके पीएससी की पीढ़ी-व्युत्पंन telencephalic जनक कोशिकाओं और monolayer संस्कृतियों के रूप में मस्तिष्क प्रांतस्था प्रक्षेपण न्यूरॉन्स शामिल हैं । ये मानकीकृत भेदभाव प्रोटोकॉल इस तरह के cortical neurogenesis4के टकसाली आदेश के रूप में मानव cortical विकास के कुछ पहलुओं को फिर से खेलना । वे, तथापि, कम गिरावट जब यह स्थानिक पैटर्न और morphogenesis के रूप में organogenesis के विकास की प्रक्रिया की recapitulation की बात आती है । स्टेम सेल जीवविज्ञान में और अधिक हाल की घटनाओं पीएससी है, जो के अनुसंधान में क्रांतिकारी बदलाव कर रहे है से 3 डी organoid संस्कृतियों की स्थापना के लिए नेतृत्व में इन विट्रो मानव organogenesis । organotypic संरचनाओं, विभिंन organoids, जो गुर्दे, आंत, आंख, और मस्तिष्क के उन सहित अंगों के मुख्य संरचनात्मक और कार्यात्मक गुणों को प्रतिबिंबित में स्वयं को पीएससी की क्षमता का उपयोग5स्थापित किया गया है । इस तरह के organoids कई अंग विशिष्ट सेलुलर उपप्रकार है, जो समूह के साथ और स्थानिक बहुत vivo5,6 मेंविकासशील अंगों के समान व्यवस्थित होते हैं । इसके अलावा, सेल संरचना, वंश संबंध, और जीन नेटवर्क के अध्ययन एकल सेल आरएनए अनुक्रमण का उपयोग कर पता चला कि मानव मस्तिष्क organoids ईमानदारी से मानव भ्रूण neocortex विकास के प्रमुख पहलुओं जैसे जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम के रूप में दोहराऊंगा 7 , 8. एक बड़ी खामी है, जो उनके व्यापक आवेदन अब तक रोका गया था, तथापि, बड़े बैच के लिए बैच रूपांतरों और organoid-organoid विविधता9।
यहां, हम एक सरल और मानकीकृत forebrain प्रकार organoid संस्कृति प्रणाली के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इस प्रणाली की प्रमुख विशेषता यह है कि यह कुशलता से और reproducibly लगभग अनंय पृष्ठीय telencephalic पहचान के पीएससी व्युत्पंन organoids उत्पंन करता है । प्रोटोकॉल हमारे हाल के सेल रिपोर्ट पेपर10में प्रयुक्त विधियों पर आधारित है । यह cortical neuroepithelium के चुनिंदा प्रेरण के साथ iPSCs की स्वयं संगठन क्षमता को जोड़ती है और मजबूती से 3 सप्ताह के भीतर जल्दी पृष्ठीय telencephalic ऊतक के सजातीय संस्कृतियों उत्पंन कर सकते हैं। प्रोटोकॉल पहले रिपोर्ट SMAD संकेतन और Wnt निषेध रणनीति है कि गाइड पूर्वकाल neuroectodermal वंश11,मैट्रिक्स embedding, जो के साथ संयोजन में12 की दिशा में पीएससी के भेदभाव पर बनाता है बड़े और सतत neuroepithelial संरचनाओं के गठन को बढ़ावा देता है13. हम सफलतापूर्वक विभिंन iPSC लाइनों पर वर्णित विधि का इस्तेमाल किया है, प्रति व्यक्ति कई क्लोन के साथ । हमें पता चला है कि इस प्रणाली के बहाव अनुप्रयोगों जिसमें reproducibility और सजातीयता रोग मॉडलिंग जैसे प्रमुख महत्व के है के लिए उपयुक्त है । जब एक गंभीर cortical कुरूपता से पीड़ित रोगियों से व्युत्पंन iPSCs के लिए प्रोटोकॉल लागू करने, हम विट्रो में रोग की बीमारी की पहचान दोहराऊंगा करने में सक्षम थे और नए आणविक phenotypic के लिए अग्रणी तंत्र की पहचान करने के लिए परिवर्तन10। हमारा सुझाव है कि वर्णित organoid प्रोटोकॉल के बीच अंतर को बंद करने के लिए उपयोग किया जा सकता है गुटबंदी पीएससी-व्युत्पंन cortical monolayer संस्कृतियों और vivo में अध्ययन, और है कि यह एक विश्वसनीय और स्थिर सेल आधारित मॉडल प्रणाली का प्रतिनिधित्व करने के लिए जल्दी अनुकरण मानव शरीर के बाहर स्वास्थ्य और रोग में मानव cortical विकास ।
वे प्रासंगिक प्रजातियों पृष्ठभूमि और एक ऊतक संदर्भ में कोशिकाओं के जटिल 3 डी व्यवस्था प्रदान करने के रूप में मस्तिष्क organoids इन विट्रो में मानव मस्तिष्क विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं । उस के साथ, वे गैर मानव पशु मॉडल और गुटबंदी मानव दो आयामी monolayer सेल संस्कृति तकनीक के बीच अंतर पुल । उनके आवेदन कर रहे हैं, तथापि, reproducibility की कमी के द्वारा बाधा9। हमने एक forebrain-प्रकार organoid प्रोटोकॉल विकसित किया है, जो नमूनों को अपनी सुविधा के साथ-साथ iPSC की क्षमता को संयोजित करके बड़े नमूना-से-नमूना परिवर्तनशीलता पर काबू पा लिया है. विशेष रूप से, iPSCs स्व-संगठन को बढ़ावा देने के लिए समेकित किया गया और बाद में TGF-ß/SMAD एक बीएमपी (LDN-१९३१८९) और एक TGF-β प्रकार मैं रिसेप्टर अवरोधक (A83-01) के लिए संस्कृतियों को उजागर करके पृष्ठीय प्रांतस्था भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए संकेतन । इसके अतिरिक्त, एक यौगिक बाधा Wnt मार्ग (IWR) posteriorization को रोकने के लिए लागू किया गया था । ‘ आंतरिक ‘ के विपरीत सेरेब्रल organoid प्रोटोकॉल19, जो स्वयं पर आधारित है बाह्य नियंत्रण के बिना नहीं बल्कि विषम मस्तिष्क organoids को जंम देने और बड़े बैच विविधताओं का प्रदर्शन कर रहे है (ध्रुवीकरण की क्षमता से मापा तंत्रिका बाह्यत्वक गठन15), यहां वर्णित प्रोटोकॉल reproducibly सजातीय forebrain मानव iPSCs से विशिष्ट organoids उत्पंन करता है ।
इन forebrain-type organoids neurodevelopmental अध्ययन, जीन समारोह अध्ययन सहित विकासवादी अध्ययन, रोग मॉडलिंग और, संभावित, दवा परीक्षण और चिकित्सीय प्रयोजनों के रूप में आवेदन की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, मानव cortical विकास के प्रारंभिक पहलुओं की जांच करने के लिए सबसे उपयुक्त प्रोटोकॉल है । हम vRGC व्यवहार के मानव-विशिष्ट पहलुओं की जांच करने के लिए forebrain प्रकार organoids इस्तेमाल किया उदाहरण के लिए है । अधिक विशेष रूप से, pathophysiological lissencephaly के एक गंभीर रूप, एक मानव cortical कुरूपता cortical तह के निकट अनुपस्थिति द्वारा विशेषता के साथ जुड़े परिवर्तन, संबोधित किया गया था । इस रोग के केवल कुछ पहलुओं चूहों में मॉडलिंग की जा सकती है के रूप में माउस मस्तिष्क स्वाभाविक रूप से lissencephalic है । जब lissencephaly रोगी के लिए organoid प्रणाली लागू-iPSCs व्युत्पंन, हम मज़बूती से मानव रोग के विशिष्ट पहलुओं दोहराऊंगा सकता है और अंतर्निहित तंत्र की पहचान । अधिक विशेष रूप से, हम प्रदर्शन कर सकते है कि रोगी व्युत्पंन organoids सममित से एक स्विच की वजह से आकार में एक महत्वपूर्ण कमी दिखाने के लिए vRGCs के असममित कोशिका विभाजन । इस स्विच vRGCs ‘ microtubule नेटवर्क, VZ आला और कोशिका आसंजन अणुओं की बदल अभिव्यक्ति की वास्तुकला का विघटन, एन के एक बिगड़ा सक्रियण के लिए अग्रणी के संगठन में परिवर्तन के साथ जुड़ा हुआ था-cadherin/β-catenin संकेतन अक्ष10। के नोट: β-catenin-vRGC विभाजन मोड के निर्भर विनियमन चूहों में β-catenin के व्यक्त रूप में मानव-विशिष्ट होने का सुझाव दिया गया था स्पर्श प्रांतस्था विस्तार करने के लिए सुराग और बाद में cortical तह20. इस प्रकार, हमारे डेटा पर प्रकाश डाला गया है कि forebrain प्रकार organoid प्रणाली एक आशाजनक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है एक quantifiable तरीके से मानव-प्रारंभिक cortical विकास इन विट्रो मेंविशिष्ट पहलुओं में अध्ययन ।
भविष्य के लिए एक बड़ी चुनौती के लिए विस्तारित समय अवधि के पार organoids की एकरूपता बनाए रखने के लिए और अधिक परिपक्व ंयूरॉन phenotypes प्राप्त करने के लिए है । यह एक या निंनलिखित के अधिक से महसूस किया जा सकता है: संवर्धन एक प्रतिक्रियात्मक प्रणाली14में organoids, अस्थाई पाड़ों15लागू करने, तंत्रिका विकास, या न्यूरॉन अस्तित्व कारकों के साथ भेदभाव मध्यम पूरक । अंत में, मस्तिष्क की जटिलता में एक नियंत्रित वृद्धि अलग क्षेत्रीय पहचान21,22के सेरेब्रल organoids के साथ forebrain प्रकार organoids से इनकार करके प्राप्त किया जा सकता है ।
एक साथ ले लिया, forebrain प्रकार organoid प्रोटोकॉल यहां प्रस्तुत एक आसानी से लागू और विश्वसनीय उपकरण जल्दी cortical संरचनाओं की पीढ़ी के लिए इन विट्रो मेंप्रदान करता है । प्रोटोकॉल कई iPSC लाइनों के पार उच्च सजातीय जल्दी cortical ऊतक को जंम देता है और मज़बूती से व्यक्तिगत विशिष्ट cortical ऊतक उत्पंन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । इस प्रकार, प्रणाली अनुप्रयोगों है कि सजातीयता और रोग मॉडलिंग के रूप में reproducibility की एक उच्च डिग्री की आवश्यकता के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है ।
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को इनोवेशन साइंस एंड रिसर्च ऑफ नार्थ रैन-Westphalia (जूनियर रिसर्च ग्रुप) द्वारा और युग-नेट न्यूरॉन, JTC २०१५ Neurodevelopmental विकारों, स्टेम-एमसीडी के द्वारा समर्थित किया गया था ।
A83-01 | StemGent | 130-106-274 | 500 nM |
B27 Supplement | Gibco | 17504-044 | 1 to 100 |
Basement membrane extract (e.g. Geltrex) | Gibco | A14132-02 | |
Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) | Sigma-Aldrich | A9501 | 0.15 µg/mL |
Cell-dissociation reagent (TrypLE Express) | Gibco | 12605028 | |
Counting chamber e.g. Fuchs-Rosenthal | Karl Hecht | 40449001 | |
D-Glucose | Carl Roth | HN06.3 | 0.2 mg/mL |
DMEM-F12 L-Glutamin | Gibco | 11320033 | |
Embedding molds (Tissue-Tek Cryomold) | Sakura Finetek | 4565 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | E6511 | 0.5 mM |
Gelantin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149-25KU | 10 ug/mL |
Inhibitor of WNT response (IWR-1) | Enzo Life Science | BML-WN103-0005 | 10 ug/mL |
Insulin | Sigma-Aldrich | 91077C | 2.5 µg/mL |
IPSC medium for monolayer cultures (Pluripro) | Cell Guidance Systems | MK01 | |
L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax) | Gibco | 35050038 | 1% |
Low-adhesion 6 cm plates | Labomedic | 2081646L | |
Low-adhesion 10 cm plates | Labomedic | 2081646O | |
LDN-193189 | Miltenyi Biotec | 130-104-171 | 180 nM |
N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | 1 to 200 |
Non-essential amino acids | Gibco | 11140035 | 0.50% |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | 4.00% |
Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 14190144 | |
Plastic paraffin film (Parafilm) | BRAND GMBH + CO KG | 701606 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02-100 | 5 µM or 50 µM |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
Tubes 15 mL | Corning Life Sciences | 734-0451 | |
Microscope Slides e.g. Superfrost Plus Microscope Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS4 | |
Tissue culture 6 well plate | Falcon | 734-0019 | |
Tissue culture 24 well plate | Falcon | 734-0949 | |
Trypan blue stain | Gibco | 15250-061 | |
Ultra-low-binding 96 well lipidure-coat plate A-U96 | Amsbio | AMS.51011610 | |
Antibodies | |||
Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | |
Pax6 | Covance | PRB-278P-100 | |
Otx2 | R&D Systems | ab9566 | |
Emx1 | Sigma | HPA006421 | |
N-cadherin | BD | 610921 | |
ZO-1 | Life Tech | 61-7300 | |
P-Vimentin | Biozol | D076-3 | |
Tpx2 | Novus Biologicals | NB500-179 | |
Acetylated α-tubulin | NEB/CS | 5335 | |
Alexa488 anti ms | Invitrogen | A11001 | |
Alexa488 anti rb | Invitrogen | A11008 | |
Alexa555 anti ms | Invitrogen | A21424 | |
Alexa555 anti rb | Invitrogen | A21429 |