שיטה משופרת עבור אוסף של נוזל של עכברים מורדם
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטת משופרת עבור אוסף עשיר של נוזל מוחי שדרתי (CSF) עם שום זיהום מדם. עם אוסף מדגם גדול יותר, טוהר, ניתוחים נוספים ניתן לבצע באמצעות נוזל מוחי-שדרתי כדי לקדם את ההבנה שלנו של מחלות המשפיעות על המוח ואת חוט השדרה.
Abstract
נוזל מוחי שדרתי (CSF) הוא נוזל גוף יקר עבור ניתוח מחקר מדעי המוח. הוא נחשב לאחד הנוזלים במגע קרוב עם מערכת העצבים המרכזית, לפיכך, יכול לשמש כדי לנתח את מצב חולה במוח או בחוט השדרה ללא גישה ישירה רקמות אלו. עם זאת, בעכברים שקשה לי לקבל מגנה cisterna בשל הקרבה שלו לכלי הדם, אשר לזהם לעיתים קרובות דגימות. האזור לאוסף CSF בעכברים גם קשה לנתח כדי, דוגמיות קטנות לעיתים קרובות בלבד מתקבלים (מרבי של 5-7 µL או פחות). פרוטוקול זה מתאר בפירוט טכניקה שיפור שיטות הנוכחי של איסוף כדי לצמצם זיהום מדם ולאפשר עבור אוסף עשיר של CSF (בממוצע שניתן לאסוף 10-15 µL). ניתן להשתמש בטכניקה זו עם שיטות אחרות לנתיחה לאיסוף רקמות של עכברים, כפי שזה לא משפיע כל רקמות במהלך שאיבת נוזל מוחי-שדרתי. לפיכך, המוח וחוט השדרה אינם מושפעים בטכניקה זו, נותרו ללא פגע. עם אוסף גדול של מדגם CSF, טוהר, ניתוחים יותר ניתן להשתמש עם מחקר מדעי המוח זה סיוע נוזלים נוספת, להבין טוב יותר מחלות התוקפות את המוח ואת חוט השדרה.
Introduction
CSF הוא נוזל גוף יקר עבור ניתוח מחקר מדעי המוח. CSF בעיקר זני פלזמה, המכיל מספר תאים (לא תאי דם אדומים, רק מספר כדוריות הדם), כמעט ללא חלבון. זה אחד הנוזלים קשר הדוק עם מערכת העצבים המרכזית (CNS), זה יכול להתעלף אלקטרוליטים רבים מן המוח וחוט השדרה במערכת ההיקפית. בבני אדם, שדרתי אפשר לאסוף כדי לסייע באבחון המחלה או למטרות מחקר בניסויים קליניים, בדיקת נוזל עמוד השדרה (או ניקור מותני) היא הליך מינורי, פולשני: נוזל CSF יכול לשקף שינויי מערכת העצבים ללא צורך לגשת ישירות אל אלה רקמות. לכן, בשנים האחרונות, למטרות מחקר במרפאה, הושגו שדרתי מחולים של מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, אחרים2,1,dementias3. ישנם מבחני סמן רבים אשר פותחו באמצעות דגימות נוזל מוחי-שדרתי פוטנציאל לסייע באבחון מחלות של המרפאה2,3. עם זאת, יש לויכוחים על האמינות של מבחני אלה כדי להפיק תוצאות עקביות, רגיש במיוחד לאבחון המחלה4,5. . כך, שאין צורך גדול להתפתחותם של מבחני טוב יותר של מטרות, אשר ניתן למצוא ב- CSF, כדי לסייע בהפקת טכניקה סטנדרטית כדי לאבחן מחלות ניווניות עם יותר רגישות וספציפיות. בשל חשיבות פוטנציאל אנושי המוחי-שדרתי במחלה, האוסף של CSF מן מכרסמים חקר המוח הוא גם עניין.
עכברים הם חיות חשוב במחקר ביולוגי ורפואי ולאפשר לבדיקה של תרכובות טיפולית פוטנציאל ולימודי הוכחה הרעיון לפני ניסויים קליניים בבני. עם זאת, בעכברים קשה להשיג דגימות נוזל מוחי-שדרתי עקב שלה קרבה אל המוח של חיים קטן, כפי השיטה הרגילה של CSF אוסף בעכברים היא כדי להשיג את זה דרך המלון cisterna, פתח בין המוח לבין המשטח הגבי של המוח המוארך. זה גורם קושי באיסוף דגימות נוזל מוחי-שדרתי ככל שהאזור הזה קשה לנתח כדי, בקרבה לכלי הדם, מעלה את הסיכון של זיהום מתאי הדם. בשל קשיים אלה, רוב החוקרים ניתן להשיג רק כמות קטנה של נוזל מוחי-שדרתי לניתוח (בדרך כלל מסר µL 5-7), הזיהום של שדרתי על ידי כדוריות הדם היא הדאגה העיקרית עבור ניתוחים-6,–7,–8 , 9. זיהום דם יכול להסתיר תוצאות, לא שיקפו את המצב של מערכת העצבים. יתר על כן, מוגבלת דגימה שנאספו יכולים להשפיע מחקר כפי שנאסף עכברים. הכמות הרגילה מספיקה לכל מדידה אחת בלבד (בכפול או משולש) שימוש assay מקושרים-אנזים immunosorbent (אליסה). לפיכך, שדרתי הם בדרך כלל איחדו של עכברים מרובים כדי שיהיה מספיק הדגימה כדי להריץ מבחני מרובים. פיתוח פרוטוקול להצפנה שופע, נערבב מהאוסף של CSF עכברים הוא נכסף, יהיה מועיל לשיפור חקר המוח באמצעות מכרסמים.
ב פרוטוקול זה, טכניקה עבור שפע (ממוצע של 10-15 µL) מהאוסף של CSF עכברים ומורדמת מתואר בפירוט ומשפר על שיטה הידועות כרגע של CSF אוסף כדי לצמצם זיהום דם10. פרוטוקול חזקים לאוסף CSF יסייעו בפיתוח של מבחני סמן מבוסס-CSF, אשר יכול לשמש כדי לסייע באבחון המחלה, כמו גם לשפר את המחקר לתוך המנגנונים העומדים בבסיס מחלות התוקפות את מערכת העצבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר בפירוט טכניקה אשר משפר את שיטות הנוכחי10 של CSF אוסף לצמצם זיהום מדם ולאפשר האוסף בשפע של CSF (בממוצע ~ 10-15 µL ניתן להשיג) של עכברים. כאשר אתה מפר את הטיפ נימי, קצה נים לא צריך להיות קטן מדי (כמו שהיית CSF יחולצו לאט מאוד) או גדול מדי (וויל לא יהיה מספיק כדי לאסוף את נוזל מ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81650110527, 81371400) הלאומי מפתח בסיסי מחקר תוכנית של סין (2013CB530900).
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer’s Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer’s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer’s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer’s Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer’s disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer’s Dement. , (2016).
- You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
