Preparação ideal de formol fixada amostras para peptídeo baseado Matrix assistida por espectrometria de massa de ionização/dessorção Laser Imaging fluxos de trabalho

Resumo

Este protocolo descreve um método reprodutível e confiável para preparação de formol fixada tecido destinado a espectrometria de massa de imagens baseada em sublimação.

Resumo

O uso de laser assistida por matriz dessorção/ionização, espectrometria de massa (MALDI MSI) de imagem rapidamente expandiu-se, uma vez que esta técnica analisa uma série de biomoléculas de drogas e lipídios para os N-glicanos. Embora existam várias técnicas de preparação de amostra, detectar peptídeos formol preservados os tecidos continua a ser um dos mais difíceis desafios para este tipo de análise de espectrometria de massa. Por esta razão, temos criado e otimizado de uma metodologia robusta que preserva as informações espaciais contidas dentro da amostra, enquanto a suscitar o maior número de peptídeos ionizáveis. Nós também ter mirado para alcançar este objectivo de forma simples e rentável, eliminando assim o possível erro viés ou preparação, que pode ocorrer quando usando automatizado instrumentação. O resultado final é um protocolo reprodutível e de baixo custo.

Introdução

Espectrometria de massa de ionização/dessorção do laser assistida por matriz (MALDI MSI) de imagem tem sido utilizada como uma técnica de imagem com base para duas décadas^1,2, analisando uma série de biomoléculas incluindo: lipídios³, peptídeos^{2 ,4}, proteínas de^2,5, metabólitos^6,7, os N-glicanos⁸e moléculas sintéticas tais como drogas terapêuticas^9,

Protocolo

Atenção: Todas as precauções de segurança devem ser seguidas quando efectuar este procedimento, incluindo a utilização de equipamento de protecção adequado (EPI) (por exemplo, aventais, luvas de nitrila, óculos de segurança, etc)

1. preparação de reagentes e equipamentos

1. Preparação das soluções
   1. Para preparar 500 mL de fluido do Carnoy, misturar 100% de etanol (EtOH), clorofórmio e ácido acético em um 6: proporção de 3:1 v/v/v num frasco Schott de vidro limpo.
   2. Para tornar o líquido nitrocelulose (NC), dissolva a membrana NC (comumente usada na mancha ocidental) em acetona pur....

Resultados

Se seguidas corretamente, este protocolo produz imagens que representam claramente a morfologia bruta do tecido sem nenhum arranhão ou outras deformações (Figura 1). A validação ideal para uma preparação de amostra realizada corretamente, é a capacidade de distinguir entre diferentes estruturas físicas, alterando a molécula sendo vistos (Figura 2).

Um bom guia para dete.......

Discussão

Este protocolo foi projetado para maximizar a geração de espécies moleculares ionizáveis, eliminando a deslocalização dos analitos. Fatores-chave envolvem usando os mesmos princípios de substituição, ao aplicar a matriz, digerindo a amostra, ou recristalização após sublimação²⁴; ou seja, que um mesmo deposição de vapor, de matriz ou caso contrário, precisa ser criado e mantido. Pipetagem lavagens de solventes para a recristalização e digestão, uniformemente debaixo da amostra, impede qualquer área.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Micrótomo criogênico	Leica	CM3050	Para preparação e seção de tecido.
O microscópio do óxido de estanho do índio desliza	Bruker	8237001	Para a preparação e a seção do tecido.
Frascos Coplin	Sigma Aldrich	S5516	Para preparação e secção de tecido.
Panela de pressão	Kambrook	KPR620BSS	Para preparação e secção de tecido.
Sublimador	Chem Glass	NA	Para procedimento de sublimação. Semelhante em design ao CG-3038, no entanto, foi feito sob medida
Banho de areia	NA	NA	Para procedimento de sublimação. Areia de rio de grau fino mantida em folha de alumínio dobrada proveniente de fora, não de nenhuma empresa específica
Placa de Petri de vidro	Sigma Aldrich	CLS70165100	Para procedimento de sublimação.
Bomba de vácuo	NA	NA	Para procedimento de sublimação. Obtido como peça de reposição de um antigo espectrômetro de massa
Armadilha fria	Chem Glass	CG-4510-02	Para procedimento de sublimação.
Placa Quente	John Morris	EW-15956-32.	Para procedimento de sublimação.
Placa de Petri de plástico	Sigma Aldrich	Z717223	Para procedimento de sublimação.
37 &graus; C incubadora	NA	NA	Para procedimento de sublimação. Não aplicável, a incubadora não é estéril e tem mais de 30 anos
Papel mata-borrão	Sigma Aldrich	P7796	Para procedimento de sublimação.
Nitrocelulose	Sigma Aldrich	N8395	Para lavagem de slides.
Acetona	Sigma Aldrich	650501	Para lavagem de lâminas.
Xileno	Sigma Aldrich	214736	Para lavagem de slides.
100% EtOH	Sigma Aldrich	1.02428	Para lavagem de slides.
70% EtOH	Sigma Aldrich	NA	Para lavagem de slides. Feito em laboratório com 95% de etanol em estoque
Clorofórmio	Sigma Aldrich	C2432	Para lavagem de slides.
Ácido acético glacial	Sigma Aldrich	ARK2183	Para lavagem de lâminas.
Tris HCL pH 8,8	Sigma Aldrich	TRIS-RO	Para clivagem proteolítica. Pó feito a 1M seguido de equilíbrio com 32% de HCl a PH 8,8
Milli Q Água Ultrapura	Sigma Aldrich	NA	Para clivagem proteolítica. Purificação realizada em casa pelo sistema de purificação de água sartorious
Bircarbonato de amônio	Sigma Aldrich	A6141	Para clivagem proteolítica.
Tripsina	Sigma Aldrich	T0303	Para clivagem proteolítica.
CHCA Matrix	Sigma Aldrich	C2020	Para recristalização.
Acetonitrila	Sigma Aldrich	1.00029	Para recristalização.
Ácido Trifluoroacético (TFA)	Sigma Aldrich	302031	Para recristalização.