Formalin की इष्टतम तैयारी के लिए निर्धारित नमूनों पेप्टाइड आधारित मैट्रिक्स असिस्टेड लेजर Desorption/Ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग वर्कफ़्लोज़
Summary
यह प्रोटोकॉल इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए किस्मत में formalin निश्चित ऊतक की उत्सादन आधारित तैयारी के लिए एक प्रतिलिपि और विश्वसनीय विधि का वर्णन करता है ।
Abstract
मैट्रिक्स के उपयोग की सहायता लेजर desorption/ionization, मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (मालदी MSI) तेजी से विस्तार किया है, के बाद से इस तकनीक का विश्लेषण दवाओं और लिपिड से अणुओं की एक मेजबान N-glycans । हालांकि विभिंन नमूना तैयारी तकनीक मौजूद है, formaldehyde संरक्षित ऊतकों से पेप्टाइड्स का पता लगाने के बड़े पैमाने पर spectrometric विश्लेषण के इस प्रकार के लिए सबसे कठिन चुनौतियों में से एक रहता है । इस कारण से, हम बनाया है और एक मजबूत पद्धति है कि स्थानिक नमूने के भीतर निहित जानकारी को बरकरार रखता है अनुकूलित है, जबकि के लिए सबसे बड़ी संख्या में है । हम भी एक लागत प्रभावी और सरल तरीके से इस लक्ष्य को प्राप्त करने के उद्देश्य से है, जिससे संभावित पूर्वाग्रह या तैयारी त्रुटि को नष्ट करने, जो हो सकता है जब स्वचालित उपकरण का उपयोग कर । अंतिम परिणाम एक प्रतिलिपि और सस्ती प्रोटोकॉल है ।
Introduction
मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption/ionization मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग (मालदी MSI) दो दशकों के लिए एक छवि आधारित तकनीक के रूप में कार्यरत किया गया है1,2, सहित अणुओं की एक श्रृंखला का विश्लेषण: लिपिड3, पेप्टाइड्स2 ,4, प्रोटीन2,5, चयापचयों6,7, एन-glycans8, और सिंथेटिक अणुओं जैसे चिकित्सीय ड्रग्स9,10। इस तकनीक की उपयोगिता के प्रदर्शन प्रकाशनों की संख्या में काफी पिछले दशक6,11,12,13से अधिक हो गए हैं । ऐसे लिपिड के रूप में कुछ अणुओं, अपेक्षाकृत आसान मालदी MSI के माध्यम से विश्लेषण करने के लिए कर रहे हैं, के रूप में वे आसानी से अपने रासायनिक प्रकृति के कारण और इस प्रकार थोड़ा पहले तैयारी3की आवश्यकता है । हालांकि, ऐसे पेप्टाइड्स के रूप में और अधिक कठिन लक्ष्य के लिए, प्रभावी रूप से इन अणुओं को रखने के लिए आवश्यक कदम व्यापक और आम तौर पर जटिल है14. वर्तमान में बहुत कुछ प्रकाशनों का उद्देश्य है कि पता करने के लिए या इस अनूठे दृश्य तकनीक के लिए ऊतक तैयार करने के लिए नियोजित कर रहे हैं कि तरीके में reproducibility का प्रदर्शन15. इस कारण से, हम एक एकल, लागू करने के लिए आसान, पद्धति है कि कोई संशोधन करने के लिए थोड़ा की आवश्यकता चाहिए, एक formaldehyde पार से लिंक किए गए ऊतक स्रोत14से पेप्टाइड्स के विश्लेषण के लिए में अवलोकन और कार्यान्वित अनुकूलन संकलित किया है.
इस पांडुलिपि में, हम formalin-फिक्स्ड जमे हुए (FFF) और formalin-फिक्स्ड आयल-एंबेडेड (FFPE) ऊतक वर्गों से उत्पंन पेप्टाइड्स का पता लगाने और स्थानिक मानचित्रण के लिए एक सत्यापित, कम लागत प्रतिलिपि पद्धति का वर्णन किया है । इस पद्धति की आवश्यकता नहीं है या किसी विशेष उपकरण3पर भरोसा करते हैं । विशेष रूप से, हम पेप्टाइड्स का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक विशेष नमूना तैयारी के कई पहलुओं का पता; antigen पुनर्प्राप्ति16 और मैट्रिक्स कोटिंग जैसे चरण । हमारे प्रोटोकॉल भी सस्ती उपकरण और रिएजेंट का इस्तेमाल करता है, जिससे इस पद्धति एक व्यापक समुदाय है जो अंयथा वैकल्पिक रोबोट उपकरण17बर्दाश्त करने में असमर्थ हो जाएगा करने के लिए सुलभ बना ।
एक मैनुअल नमूना तैयारी विधि विकसित करने के पीछे तर्क दो गुना था: सबसे पहले, एक sublimator का उपयोग मैट्रिक्स क्रिस्टल के एक सुसंगत और समरूप कोटिंग बनाता है कि ~ 1 लंबाई में µm है18, और अधिक आम छिड़काव के साथ कुछ प्राप्त नहीं तकनीक. दूसरे, अपेक्षाकृत छोटे सेट लागत: कस्टम तंत्र की कुल लागत था < $1500 AUD । हम ध्यान दें, लागत प्रभावशीलता के संदर्भ में, नमूना प्रति मूल्य अभी तक सस्ता है जब वहां कोई रोबोट मशीनरी शामिल है । उत्सादन का उपयोग पहले सूचित किया गया है, तथापि, हमारे ज्ञान का सबसे अच्छा करने के लिए, कदम दर कदम तरीके कि इस प्रक्रिया का वर्णन और नमूना तैयारी रिपोर्ट नहीं किया गया है और न ही साहित्य में वर्णित है ।
इस प्रोटोकॉल के लिए शोधकर्ताओं कि एक मालदी जन स्पेक्ट्रोमीटर के लिए उपयोग किया है और जो एक जैव के संबंध में स्थानिक जानकारी पैदा करने पर आमादा है सहायता करना है19ब्याज की अणु । संक्षेप में, मालदी MSI ऊतकीय स्क्रीनिंग का एक रूप है कि एंटीबॉडी या दाग2पर भरोसा नहीं करता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल analytes के स्थानीयकरण को नष्ट करते हुए, विस्तृत आणविक प्रजातियों की पीढ़ी को अधिकतम करने के लिए डिज़ाइन किया गया था । मुख्य कारक एक ही अवहेलना सिद्धांत का उपयोग कर जब मैट्रिक्स लागू करने, नमून?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक के लिए सिडनी मेडिकल स्कूल फाउंडेशन और उदास और उनके अल्जाइमर रोग अनुसंधान के लिए पीएचडी छात्रवृत्ति कार्यक्रम के माध्यम से इस काम के वित्तपोषण भाग के लिए फाउंडेशन और एक चाप डिस्कवरी अनुदान (DP160102063) PKW को संमानित स्वीकार करना चाहूंगा ।
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
Referências
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
- O’Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
- O’Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
- Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
- Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, 11 (2012).
- Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).
- O’Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
- Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
- . Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, 55 (1925).
- Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
- Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
- Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
- Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
- Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
- Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
- Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium – application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).
