Optimal utarbeidelse av Formalin fast prøver for peptid basert Matrix assistert Laser desorpsjon/ionisering massespektrometri Imaging arbeidsflyter
Summary
Denne protokollen beskriver en reproduserbar og pålitelig metode for sublimering-baserte utarbeidelse av formalin fast vev til tenkelig massespektrometri.
Abstract
Bruk av matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering, massespektrometri imaging (MALDI MSI) har ekspandert, siden denne teknikken analyserer en rekke biomolecules fra narkotika og lipider til N-glykaner. Selv om ulike eksempel forberedelser teknikker finnes, fortsatt oppdage peptider fra formaldehyd bevart vev en av de vanskeligste utfordringene for denne massen spectrometric analyse. Derfor har vi opprettet og optimalisert robust metode som bevarer romlige informasjonen i utvalget, mens fremlokkende flest ionizable peptider. Vi har også som mål å oppnå dette på en kostnadseffektiv og enkel måte, og dermed eliminere potensielle skjevhet eller forberedelse feil som kan oppstå når ved hjelp av automatisert instrumentering. Sluttresultatet er en reproduserbar og rimelig protokoll.
Introduction
Matrix-assistert laser desorpsjon/ionisering massespektrometri imaging (MALDI MSI) har vært ansatt som en basert teknikk for to tiår1,2, analysere en rekke biomolecules inkludert: lipider3, peptider2 ,4, proteiner2,5, metabolitter6,7, N-glykaner8og syntetisk molekyler som terapeutiske narkotika9,10. Hvor mange publikasjoner demonstrere nytten av denne teknikken har vokst betydelig de siste tiår6,11,12,13. Visse molekyler, som lipider, er relativt enkle å analysere via MALDI MSI, som de ionisere lett på grunn av deres kjemiske natur og krever derfor litt tidligere forberedelse3. Men for mer vanskelig mål som peptider er trinn kreves for å effektivt ionisere disse molekylene omfattende og generelt kompliserte14. Det er svært få publikasjoner som mål å adresse eller demonstrere reproduserbarhet i metoder som er ansatt for å forberede vev denne unike visuelle teknikk15. Derfor har vi samlet observasjoner og implementert optimaliseringer i én enkelt å implementere, krysskoblet metodikk som bør kreve liten eller ingen endring, for analyse av peptider fra en formaldehyd vev kilde14.
I dette manuskriptet har vi beskrev en validert, lavpris reproduserbar metode av romlige kartlegging av peptider, generert fra formalin-fast frosne (FFF) og formalin-fast parafin-embedded (FFPE) vev inndelinger. Denne metoden krever ikke eller stole på noen spesialisert instrumentering3. Spesielt ta vi mange aspekter av spesialiserte eksempel forberedelse nødvendig å analysere peptider; trinn som antigen henting16 og matrix belegg. Våre protokollen utnytter også billig utstyr og reagenser, og dermed gjør denne metodikken tilgjengelig for et bredere fellesskap som ellers ikke råd til de alternative robot apparater17.
Begrunnelsen bak utviklet en manuell eksempel forberedelse metoden var todelt: først, bruk av en sublimator skaper et enhetlig og homogene belegg av matrix krystaller som er ~ 1 µm lengde18, noe uoppnåelig med mer vanlig sprøyting teknikker. Dernest den relativt liten etableringskostnader: den totale kostnaden av tilpassede apparater var <$ 1500 AUD. Vi merke, i form av kosteffektivitet, prisen per eksempel er langt billigere når det er ingen robotsveising maskiner involvert. Bruk av sublimering har rapportert tidligere, men best av vår kunnskap, trinnvise metoder som beskriver denne prosessen og prøve forberedelse ikke har vært rapportert eller beskrevet i litteraturen.
Denne protokollen er ment å hjelpe forskere som har tilgang til en MALDI masse spectrometer og som er innstilt på å generere romlig informasjon i forbindelse med en bio-molekylet interesse19. I hovedsak er MALDI MSI en form for histologiske screening som ikke er avhengig av antistoffer eller flekker2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen ble utformet for å maksimere generasjonen av ionizable molekylær arter mens de eliminerer delocalization av analytter. De viktigste faktorene skal bruke samme overordnede prinsipp når matrise, fordøye prøven eller recrystallizing etter sublimering24; nemlig, at en selv deponering av damp, matrise eller ellers må opprettes og vedlikeholdes. Pipettering løsemiddel vasker for recrystallization og fordøyelsen, jevnt under prøven, hindrer noen personlige området mottar mer l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Sydney Medical School Foundation og Blues og grunnlaget for finansiering del av dette arbeidet gjennom sine PhD Stipendprogram for Alzheimers sykdom forskning og en bue Discovery stipend (DP160102063) tildelt PKW.
Materials
| Cryo Microtome | Leica | CM3050 | For preparation and section of tissue. |
| Indium Tin Oxide Microscope slides | Bruker | 8237001 | For preparation and section of tissue. |
| Coplin Jars | Sigma Aldrich | S5516 | For preparation and section of tissue. |
| Pressure Cooker | Kambrook | KPR620BSS | For preparation and section of tissue. |
| Sublimator | Chem Glass | NA | For sublimation procedure. Similar in design to the CG-3038 however it was custom made |
| Sand bath | NA | NA | For sublimation procedure. Fine grade river sand held in folded aluminium foil sourced from outside not from any specific company |
| Glass Petri Dish | Sigma Aldrich | CLS70165100 | For sublimation procedure. |
| Vacuum Pump | NA | NA | For sublimation procedure. Sourced as a spare part from an old mass spectrometer |
| Cold trap | Chem Glass | CG-4510-02 | For sublimation procedure. |
| Hot Plate | John Morris | EW-15956-32. | For sublimation procedure. |
| Plastic petri dish | Sigma Aldrich | Z717223 | For sublimation procedure. |
| 37 °C incubator | NA | NA | For sublimation procedure. Not applicable, incubator is non sterile and over 30 years old |
| Blotting paper | Sigma Aldrich | P7796 | For sublimation procedure. |
| Nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8395 | For washing of slides. |
| Acetone | Sigma Aldrich | 650501 | For washing of slides. |
| Xylene | Sigma Aldrich | 214736 | For washing of slides. |
| 100% EtOH | Sigma Aldrich | 1.02428 | For washing of slides. |
| 70% EtOH | Sigma Aldrich | NA | For washing of slides. Made in lab from 95% stock ethanol |
| Chloroform | Sigma Aldrich | C2432 | For washing of slides. |
| Glacial Acetic Acid | Sigma Aldrich | ARK2183 | For washing of slides. |
| Tris HCL pH 8.8 | Sigma Aldrich | TRIS-RO | For proteolytic cleavage. Powder made to 1M followed by equilibration with 32% HCl to PH 8.8 |
| Milli Q Ultra-Pure Water | Sigma Aldrich | NA | For proteolytic cleavage. Purification performed in house by sartorious water purification system |
| Ammonium Bircarbonate | Sigma Aldrich | A6141 | For proteolytic cleavage. |
| Trypsin | Sigma Aldrich | T0303 | For proteolytic cleavage. |
| CHCA Matrix | Sigma Aldrich | C2020 | For recrystallisation. |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 1.00029 | For recrystallisation. |
| Trifluoroacetic Acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | For recrystallisation. |
Referências
- Schwartz, S. A., Reyzer, M. L., Caprioli, R. M. Direct tissue analysis using matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry: practical aspects of sample preparation. J Mass Spectrom. 38 (7), 699-708 (2003).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological Samples: Localization of Peptides and Proteins Using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
- Jackson, S. N., et al. MALDI-Ion Mobility Mass Spectrometry of Lipids in Negative Ion Mode. Analytical methods : advancing methods and applications. 6 (14), 5001-5007 (2014).
- O’Rourke, M. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A non-instrument-based method for the analysis of formalin-fixed paraffin-embedded human spinal cord via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (19), 1836-1840 (2015).
- O’Rourke, M. B., Raymond, B. B. A., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (7), 637-644 (2015).
- Chughtai, K., Heeren, R. M. Mass spectrometric imaging for biomedical tissue analysis. Chem Rev. 110 (5), 3237-3277 (2010).
- Ye, H., et al. MALDI mass spectrometry-assisted molecular imaging of metabolites during nitrogen fixation in the Medicago truncatula-Sinorhizobium meliloti symbiosis. Plant J. 75 (1), 130-145 (2013).
- Powers, T. W., et al. MALDI imaging mass spectrometry profiling of N-glycans in formalin-fixed paraffin embedded clinical tissue blocks and tissue microarrays. PLoS One. 9 (9), 10655 (2014).
- Rompp, A., Spengler, B. Mass spectrometry imaging with high resolution in mass and space. Histochem Cell Biol. 139 (6), 759-783 (2013).
- Shariatgorji, M., Svenningsson, P., Andren, P. E. Mass spectrometry imaging, an emerging technology in neuropsychopharmacology. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 34-49 (2014).
- Alexandrov, T. MALDI imaging mass spectrometry: statistical data analysis and current computational challenges. BMC Bioinformatics. 13, 11 (2012).
- Weaver, E. M., Hummon, A. B. Imaging mass spectrometry: From tissue sections to cell cultures. Adv Drug Deliv Rev. 65 (8), 1039-1055 (2013).
- Watrous, J. D., Dorrestein, P. C. Imaging mass spectrometry in microbiology. Nat Rev Microbiol. 9 (9), 683-694 (2011).
- O’Rourke, M., Padula, M. The Non-Instrument Based Preparation of Tissue Samples Destined for Imaging Mass Spectrometry (IMS) Analysis. Protocol Exchange. , (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. A new standard of visual data representation for imaging mass spectrometry. Proteomics Clin Appl. 11 (3-4), (2017).
- O’Rourke, M. B., Padula, M. P. Analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue via proteomic techniques and misconceptions of antigen retrieval. Biotechniques. 60 (5), 229-238 (2016).
- Casadonte, R., Caprioli, R. M. Proteomic analysis of formalin-fixed paraffin-embedded tissue by MALDI imaging mass spectrometry. Nat. Protocols. 6 (11), 1695-1709 (2011).
- Ong, T. H., et al. Mass Spectrometry Imaging and Identification of Peptides Associated with Cephalic Ganglia Regeneration in Schmidtea mediterranea. J Biol Chem. 291 (15), 8109-8120 (2016).
- Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
- . Blood-smear showing Experimental Infection with Herpetomonas. Proc R Soc Med. 18, 55 (1925).
- Gorrie, C. A., et al. Effects of human OEC-derived cell transplants in rodent spinal cord contusion injury. Brain Res. 1337, 8-20 (2010).
- Wu, Q., Comi, T. J., Li, B., Rubakhin, S. S., Sweedler, J. V. On-Tissue Derivatization via Electrospray Deposition for Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging of Endogenous Fatty Acids in Rat Brain Tissues. Anal Chem. 88 (11), 5988-5995 (2016).
- Sturm, R. M., Greer, T., Chen, R., Hensen, B., Li, L. Comparison of NIMS and MALDI platforms for neuropeptide and lipid mass spectrometric imaging in C. borealis brain tissue. Anal Methods. 5 (6), 1623-1628 (2013).
- Kompauer, M., Heiles, S., Spengler, B. Atmospheric pressure MALDI mass spectrometry imaging of tissues and cells at 1.4-mum lateral resolution. Nat Methods. 14 (1), 90-96 (2017).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Anal Chem. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Rohner, T. C., Staab, D., Stoeckli, M. MALDI mass spectrometric imaging of biological tissue sections. Mech Ageing Dev. 126 (1), 177-185 (2005).
- Li, B., Bhandari, D. R., Rompp, A., Spengler, B. High-resolution MALDI mass spectrometry imaging of gallotannins and monoterpene glucosides in the root of Paeonia lactiflora. Sci Rep. 6, 36074 (2016).
- Spengler, B. Mass spectrometry imaging of biomolecular information. Anal Chem. 87 (1), 64-82 (2015).
- Widlak, P., et al. Detection of molecular signatures of oral squamous cell carcinoma and normal epithelium – application of a novel methodology for unsupervised segmentation of imaging mass spectrometry data. Proteomics. 16 (11-12), 1613-1621 (2016).
