Um cinética baseada em fluorescência Ca2 + mobilização ensaio para identificar agonistas do Receptor acoplado à proteína G, antagonistas e moduladores alostéricos
Summary
O ensaio de celular descrito destina-se a identificação do receptor do chemokine do CXC 4 (CXCR4)-interação agentes que inibem ou estimulam, competitivos ou qual alostericamente, o intracelular Ca2 + lançamento iniciado pela ativação de CXCR4.
Abstract
G receptores (GPCRs) são de grande importância para a indústria farmacêutica como eles estão envolvidos em muitas doenças humanas e incluem metas bem validadas para a intervenção terapêutica. Descoberta de compostos de chumbo, incluindo pequenas moléculas sintéticas, que inibem especificamente a função do receptor, é um passo inicial importante no desenvolvimento de drogas e se baseia em ensaios de cell-based sensíveis, específicos e robustos. Aqui, descrevemos um ensaio cinético de celular com um visor fluorescente projetado principalmente para identificar os antagonistas de receptores específicos que inibem o intracelular Ca2 + lançamento evocado mediante a ativação do receptor chemokine CXC 4 (CXCR4) por seu ligante endógeno, o ligante de chemokine CXC 12 (CXCL12). A principal vantagem deste método é que ele também permite o rastreio dos compostos dotados de propriedades intrínsecas de agonísticos (ou seja, compostos, provocando um aumento de Ca2 + concentração intracelular na ausência de CXCL12) ou compostos função do receptor através da interação com sítios de ligação alostéricos de modulação (ou seja, moduladores alostéricos positivos e negativos (PAMs e NAMs, respectivamente)). No lado de baixo, autofluorescent compostos podem interferir com a leitura do ensaio, prejudicando, assim, interpretação de dados fiáveis. Muito provavelmente este ensaio pode ser implementado, com mínimas adaptações, como um ensaio de descoberta de medicamentos genéricos para muitos outros GPCRs cuja a ativação leva à liberação de Ca intracelular2 +.
Introduction
GPCRs são uma importante superfamília de proteínas de superfície celular que ativam cascatas de transdução de sinal com ligação ligante extracelular. Eles podem ser ativados por uma grande variedade de estímulos, incluindo hormônios proteicos, peptídeos, aminas biogênicas e lipídios, o que resulta no início de diversas vias de sinalização intracelulares e respostas biológicas eventualmente1,2 . Além disso, GPCRs estão envolvidos em muitos, se não todos, processos fisiológicos e de desenvolvimento e muitas doenças humanas são associadas com superexpressão de sinalização ou receptor GPCR disfuncional. GPCRs são, portanto, entre os alvos farmacológicos mais validados em medicina1,3.
Normalmente, um fluxo de trabalho de descoberta de drogas GPCR começa com ensaios de rastreio celular permitindo a identificação de compostos como pequenas moléculas, anticorpos monoclonais e peptídeos que podem modular a atividade de um determinado GPCR. Na descoberta da droga GPCR muitos tipos diferentes de ensaios existem para pesquisar por tais compostos, a maioria dos quais são compatíveis com campanhas de meados – a seleção da elevado-produção. Os ensaios mais utilizados incluem experiências de ligação do receptor, fluorescência ou luminescência com base em ensaios de detecção de flutuações no nível dos chamados mensageiros secundários (por exemplo, Ca2 +, adenosina monofosfato cíclica (AMP)), fenotípicos ensaios de triagem e recrutamento de β-arrestin ensaios4. A escolha de um determinado tipo de ensaio pode depender de vários fatores, mas também é determinada pelo conhecimento prévio das propriedades de sinalização de um determinado GPCR. Agonista obrigatório para um GPCR induz uma mudança conformacional catalisar a troca de difosfato de guanidina (PIB) para trifosfato de guanidina (GTP) sobre a subunidade α-de proteínas via G. Posteriormente a subunidade de -GTP Gαdissocia-se da subunidadeβγ de G… e as duas subunidades iniciará novas vias de sinalização. Hidrólise da molécula de GTP e subsequente re-associação da Gα– PIB e Gβγ subunidades irão restaurar a proteína G em sua conformação inativa5,6. Com base na similaridade da sequência de subunidadeα G são definidos diferentes tipos de proteínas G (G,s, G,eu, Gq, G12/13)7. Sinalização através da Gα subunidade dá origem a várias respostas típicas, tais como o aumento (via Gs) ou diminuir (via Geu) de produção de AMP cíclico e Ca2 + mobilização intracelular (via Gq)5 ,7. Gβγ subunidades são também capazes de induzir vias efetoras intracelulares. Por exemplo, após a ativação de Geu-GPCRs acoplados, Gβγ diretamente podem estimular a fosfolipase C (PLC-β) para produzir o inositol trifosfato (IP3) que provoca a liberação de Ca2 + do intracelulares lojas7 . Após a ativação do receptor, GPCRs são fosforiladas por quinases GPCR (GRKs), que promove a interação com β-arrestins. Este processo termina a sinalização de proteína G e leva a internalização e, eventualmente, a dessensibilização do receptor. Β-arrestins também são capazes de formar complexos multi moleculares que podem desencadear outras vias de sinalização independentes da proteína G sinalização8.
Dentro da subfamília de chemokine receptores, o Geu-CXCR4 acoplado é um GPCR que suscitou muito interesse como um alvo promissor para a descoberta de medicamentos. Dado seu papel estabelecido como um grande receptor de co para vírus de imunodeficiência humana 1 (HIV-1) entrada viral e infecção, compostos visando CXCR4 foram inicialmente desenvolvidos como anti-VIH droga candidatos9. Mais recentemente, um conjunto crescente de evidências tem apontado um papel importante para CXCR4 em metástase tumorigênese e câncer, tornando-se um alvo terapêutico bem validado em Oncologia também10. CXCR4 é altamente expressa em mais de vinte tipos de câncer humano e sobrevivência de células de tumor de controles, proliferação e migração, bem como relacionados ao tumor angiogênese10. Antagonistas de CXCR4 de diferentes classes químicas anteriormente foram descritos11,12, mas só a pequena molécula que AMD3100 atualmente é aprovado para uso na clínica como um agente de mobilização de células-tronco utilizado durante o tratamento de linfoma e pacientes de mieloma13,14. Ensaios clínicos estão em andamento para avaliar a segurança e a eficácia dos vários outras antagonistas de CXCR4 em diferentes doenças humanas, mas com um forte foco na oncologia12. Tendo em conta as muitas aplicações potenciais para CXCR4 antagonistas, a busca de novos compostos com propriedades farmacocinéticas melhoradas, melhor biodisponibilidade ou potencialmente menos efeitos colaterais é garantida.
Neste documento, um ensaio de celular baseado em fluorescência cinético usada principalmente para tela para compostos capazes de inibir o CXCR4 é descrita. A medição fluorescente desse método baseia-se o aumento transiente de Ca2 + concentração intracelular evocado após a ativação de CXCR4 pelo seu agonista endógena, o ligante de chemokine CXCL12 (anteriormente conhecido como células do estroma derivadas fator 1 α ( SDF1-α)) e a inibição de potencial desta resposta2 + Ca CXCL12-induzida por compostos particulares. Neste ensaio, células de glioblastoma humano u-87 estàvel expressando o receptor CXCR4 humano são utilizadas. Ao mesmo tempo, estas células faltam expressão endógena de CXCR7, um receptor do chemokine relacionados que também vincula CXCL1215,16,17. CXCR7 anteriormente também foi mostrado para ser capaz de formar heterodímeros com CXCR4, desse modo, modulando as propriedades sinalização deste último receptor18. Flutuações no nível de intracelular Ca2 + mediada por CXCR4 são monitoradas por carregar o CXCR4+ células com éster acetoximetil fluo-2 (AM), uma célula-permeável de alta afinidade fluorescente Ca2 +-vinculação a tintura. Fluo-2 AM é uma molécula fluorescente único comprimento de onda que pode ser excitada em 490 nm, enquanto sua emissões a fluorescência é medida em 520 nm. Esta fluorescência de emissão aumenta em cima de Ca2 + ligação, com um grande alcance dinâmico entre a Ca2 +-vinculado e não vinculado a estado. O aumento do sinal fluorescente é transitório, ocorrendo dentro de um intervalo de tempo de alguns minutos e irá decair depois. A altura da emissão fluorescente mais correlaciona-se com o nível de ativação do receptor. O ensaio em si é executado usando um leitor de microplacas de fluorescência equipado com uma câmera CCD intensificou-se (ICCD) que possui um sistema de pipetagem integrado que permite a padronização das etapas pipetagem no ensaio (ver Tabela de materiais) . Além disso, a medição simultânea do sinal fluorescente em todos os poços de uma microplaca é outra grande vantagem do leitor de fluorescência que é usado. Durante a primeira parte do ensaio os compostos sob investigação (por exemplo, um painel de pequenas moléculas com uma concentração fixa ou em uma série de diluição) são adicionados à AM fluo-2 carregado CXCR4+ u-87 células seguiram por um ~ período de incubação de 10 min durante o qual o potencial efeito agonístico dos compostos é continuamente medido em tempo real. Em seguida, o agonista endógeno (i.e., CXCL12) é adicionado às células para evocar um aumento transiente CXCR4-mediada do nível intracelular Ca2 +. Durante esta parte do ensaio pode ser avaliada a potencial atividade antagonista dos compostos testados. Uma visão esquemática do fluxo de trabalho geral do ensaio é apresentada na Figura 1.
Embora este ensaio de Ca2 + mobilização tem sido usado principalmente para identificar e determinar a potência inibitória dos antagonistas competitivas de CXCR4 (ou seja, compostos que impedem que o agonista endógeno para vincular e estimulam o receptor), também pode identificar agonistas dos receptores e, além disso, os compostos que exercem sua função por ligação alostéricos locais (ou seja, sites que topograficamente diferem o sítio de ligação do orthosteric ocupado pelo agonista endógeno). Exemplos desta última categoria de compostos agonistas alostéricos e PAMs e NAMs19,20. Considerando que os antagonistas dos receptores específicos, bem como NAMs iria inibir a resposta2 + Ca induzida por CXCL12, PAMs aumentaria essa resposta (Veja também discussão seção). Embora o ensaio aqui descritos especificamente metas CXCR4, prevê-se que este método pode ser aplicado a outros GPCRs com esforço de otimização mínima, pelo menos se eles sinal através do lançamento do intracelular Ca2 +.
Protocol
Representative Results
Discussion
O Ca2 +-ensaio de mobilização aqui descrito anteriormente foi mostrado para ser uma ferramenta valiosa para identificar e caracterizar os antagonistas dos receptores CXCR417de direcionamento. No entanto, prevê-se que este método pode ser mais geralmente aplicado a um grupo grande de outros GPCRs que desencadeiam um citosólico Ca2 + lançamento após a sua ativação, conforme ilustrado pelo receptor relacionados chemokine CCR5. Considerando que, no caso de CCR5 poderiam …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer Eric Fonteyn e Geert Schoofs excelente assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo KU Leuven (conceder n. PF/10/018), o Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO, conceder n. G.485.08) e a Fondation Dormeur Vaduz.
Materials
| Fluo-2 AM | Abcam | ab142775 | fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | pluronic acid |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| AMD3100 | Sigma | A5602-5 mg | specific CXCR4 antagonist |
| Maraviroc | kind gift of AnorMed | antiretroviral drug, CCR5 antagonist | |
| Chemokine ligand CXCL12 | PeproTech | 300-28A | |
| Chemokine ligand CCL5 | PeproTech | 300-06 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco (Life Technologies) | 10270-106 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A1933-25G | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Gibco (Life Technologies) | 41965-039 | |
| HBSS (10 x), calcium, magnesium, no phenol red | Gibco (Life Technologies) | 14065-049 | |
| HEPES (1 M) | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Trypsin-EDTA (0,25 %), phenol red | Gibco (Life Technologies) | 25200-056 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | Gibco (Life Technologies) | 14190-094 | |
| Falcon tubes, 50 mL | Greiner Bio-One | 227 261 | |
| Tissue culture flask (T75) | Corning | 353024 | |
| Black plate, 96-well, clear bottom, with lid | Costar/Fisher Scientific | 10530753 | assay plate (96-well), for cell seeding |
| Polypropylene (PP) plates | Thermo Scientific (VWR) | 732-2661 | plates used to prepare the compound plates and chemokine plates, round bottom |
| FLIPR Tetra high throughput cellular screening system | Molecular Devices | Fluorescent plate reader with integrated pipettor head and ICCD camera | |
| FLIPR Tetra LED Module 470 – 495 nm | Molecular Devices | 0200-6128 | Light emitting diodes for excitation of the fluorescent Ca2+ sensitive dye |
| FLIPR Tetra Emission Filter 515 – 575 nm | Molecular Devices | 0200-6203 | emission filter compatible with the fluorescent dye |
| FLIPR Tetra 96 Head | Molecular Devices | 0310-4536 | 96-well pipettor head, integrated within the fluorescent plate reader |
| ScreenWorks | Molecular Devices | software package used for data analysis and visualization on the FLIPR Tetra | |
| Vi-CELL | Beckman Coulter | cell viability analyzer | |
| Corning CellBIND 96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene Microplates, with Lid, Sterile | Corning | 3340 | Pre-coated 96-well assay plates that may represent an alternative for manual coating of the assay plate. |
Referências
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