Zika वायरस विशिष्ट नैदानिक Epitope डिस्कवरी
Summary
इस प्रोटोकॉल में, हम एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray का उपयोग Zika वायरस विशिष्ट नैदानिक पेप्टाइड्स की खोज करने के लिए एक तकनीक का वर्णन । इस प्रोटोकॉल को पढ़ने के अंय उभरते संक्रामक रोगों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Abstract
उच्च घनत्व पेप्टाइड microarrays एक मानक माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर ६००० से अधिक पेप्टाइड्स की स्क्रीनिंग की अनुमति देते हैं । इस विधि दवा की खोज, चिकित्सकीय लक्ष्य पहचान, और निदान के विकास के लिए लागू किया जा सकता है । यहाँ, हम एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray का उपयोग कर विशिष्ट Zika वायरस (ZIKV) नैदानिक पेप्टाइड्स की खोज करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । एक मानव सीरम नमूना ZIKV संक्रमण के लिए मान्य एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray पूरे ZIKV प्रोटीन युक्त एक 14-aa अवशेषों के साथ डुप्लिकेट में मुद्रित ३,४२३ अद्वितीय 15 रैखिक एमिनो एसिड (ए. ए.) अवशेषों में अनुवादित किया गया था । एक ही सरणी के भीतर विभिंन माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ धुंधला, हम पेप्टाइड्स कि Immunoglobulin एम (आईजीएम) और Immunoglobulin जी (आईजीजी) सीरम में मौजूद एंटीबॉडी को बांध का पता चला. इन पेप्टाइड्स का चयन आगे सत्यापन प्रयोगों के लिए किया गया. इस प्रोटोकॉल में, हम डिजाइन, प्रक्रिया के बाद की रणनीति का वर्णन है, और एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray का विश्लेषण ।
Introduction
Zika वायरस (ZIKV) नैदानिक लक्षणों के आधार पर निदान चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह वैक्टर, भौगोलिक वितरण, और डेंगू और Chikungunya वायरस के संक्रमण के साथ लक्षण के शेयरों1। गर्भावस्था के दौरान ZIKV से संक्रमित महिलाओं में प्रतिकूल गर्भावस्था परिणामों के लिए जोखिम को देखते हुए, यह 3 वायरस के बीच अंतर करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि वर्तमान आणविक नैदानिक परीक्षणों विशिष्ट हैं, वे केवल तीव्र संक्रमण2,3की अपेक्षाकृत कम अवधि के दौरान रक्त या लार में उपयोगी होते हैं । सीरम वैज्ञानिक परख संक्रमण के इस प्रारंभिक अवधि के बाहर निदान के लिए आवश्यक है 4 ।
एक ZIKV विशिष्ट सीरम वैज्ञानिक परख के विकास के दो कारणों के लिए चुनौतीपूर्ण है: पहले, Zika एंटीजन है कि मानव प्रतिरक्षा प्रणाली का जवाब वर्तमान में ज्ञात नहीं हैं; और दूसरा, संरक्षित flaviviruses एमिनो एसिड अनुक्रम एंटीबॉडी पार जेट प्रेरित । हमारा उद्देश्य निदान में इस्तेमाल किया जा करने के लिए अद्वितीय ZIKV विशिष्ट पेप्टाइड्स की खोज करने के लिए किया गया था । विभिंन दृष्टिकोण फेज, जीवाणु, और खमीर सतह प्रदर्शन5,6,7,8,9सहित पूरे प्रोटीन को कवर पेप्टाइड पुस्तकालयों के लिए विकसित किया गया है, 10. हमारी रणनीति के लिए एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray है कि तेजी से और सस्ती उच्च प्रवाह परमिट सीरम वैज्ञानिक 11, 12 और बाद में पहचान पेप्टाइड्स वर्तमान सीरम वैज्ञानिक में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अनुमति का उपयोग करने के लिए किया गया ZIKV संक्रमण का पता लगाने के लिए परख ।
यह प्रोटोकॉल एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray (चित्रा 1) का उपयोग कर Zika वायरस विशिष्ट नैदानिक पेप्टाइड्स की खोज को सक्षम करता है । उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray पेप्टाइड लेजर मुद्रण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर उत्पादित किया गया था । पूरे ZIKV प्रोटीन ३,४२३ अमीनो एसिड फ्रेंच Polynesian तनाव (GenBank: kj 776791.2) के आधार पर अवशेषों से मिलकर अनुक्रम, एक के लिए डुप्लिकेट में 14 एमिनो एसिड अवशेषों की एक ओवरलैप के साथ 15 रैखिक अवशेषों के ब्लॉक में एक मानक गिलास स्लाइड पर मुद्रित किया गया था कुल ६,८४६ पेप्टाइड स्पॉट । पूरे Zika प्रोटीन अनुक्रम पेप्टाइड्स के अलावा, microarray इंफ्लूएंजा hemagglutinin का उपयोग करता है (हा) आंतरिक नियंत्रण के लिए पेप्टाइड्स ।
एक Zika सत्यापित सकारात्मक सीरम Wadsworth केंद्र से प्राप्त नमूना (Albany, NY), विशिष्ट Immunoglobulin एम (आईजीएम) और Immunoglobulin जी (आईजीजी) प्रतिक्रियाशील पेप्टाइड्स की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. नमूना रात भर के साथ मशीन के बाद, microarray एक माध्यमिक fluorochrome संयुग्मित एंटीबॉडी (विरोधी मानव आईजीएम या विरोधी मानव आईजीजी) के साथ दाग था, और एक microarray स्कैनर पर विश्लेषण किया । स्पॉट तीव्रता और पेप्टाइड एनोटेशन के ठहराव एक विशिष्ट एक ही कंपनी है कि microarray निर्मित द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर के साथ प्रदर्शन किया गया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक उच्च घनत्व पेप्टाइड microarray पूरे Zika वायरस प्रोटीन अनुक्रम (फ्रेंच Polynesian तनाव) युक्त उपयोग प्रोटोकॉल बनाया । microarray मुद्रण ३,४२३ अलग अतिव्यापी रैखिक पेप्टाइड्स द्वारा निर्मित किया गया था । प्रत्येक पेप्ट…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वर्तमान समर्थन NIDCRR44 DE024456 से एक SBIR (लघु व्यवसाय नवाचार अनुसंधान) प्रशासनिक अनुपूरक अनुदान द्वारा प्रदान की जाती है । NIDCR एचआईवी अनुदान है कि NIDCR अनुदान U01 DE017855 से बाहर एचआईवी के लिए एक पुष्टि बिंदु की देखभाल नैदानिक के विकास के लिए विकसित की है । हम कृतज्ञता उसे तकनीकी सहायता और तरह के समर्थन के लिए रेशमी Weisenburger (PEPperPRINT हीडलबर्ग, जर्मनी) स्वीकार करते हैं । हमने ली-ï ओडिसी इमेजिंग सिस्टम के लिए NYU Langone मेडिकल सेंटर का भी शुक्रिया अदा किया ।
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
Referências
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