Zika Virus spesifikke diagnostiske Epitope oppdagelsen
Summary
I denne protokollen beskriver vi en teknikk for å oppdage Zika virus spesifikke diagnostiske peptider ved hjelp av en høy tetthet peptid microarray. Denne protokollen kan readly tilpasses for andre fremvoksende infeksjonssykdommer.
Abstract
Høy tetthet peptid microarrays kan screening av mer enn seks tusen peptider i et enkelt standard mikroskopi lysbilde. Denne metoden kan brukes for medisiner, terapeutiske mål identifisering og utvikling av diagnostikken. Her presenterer vi en protokoll for å finne bestemte Zika virus (ZIKV) diagnostiske peptider ved hjelp av en høy tetthet peptid microarray. En humant serum prøve godkjent for ZIKV infeksjon ble inkubert med en høy tetthet peptid microarray som inneholder hele ZIKV protein oversatt 3,423 unike 15 lineær aminosyre (aa) rester med en 14-aa rester overlapping trykt i duplikat. Flekker med ulike sekundære antistoffer i samme array, oppdaget vi peptider som binder seg til immunglobulin M (IgM) og immunglobulin G (IgG) antistoffer i serum. Disse peptider ble valgt for ytterligere validering eksperimenter. I denne protokollen beskriver vi strategien følges for å utforme, behandle og analysere en høy tetthet peptid microarray.
Introduction
Zika virus (ZIKV) diagnose basert på kliniske symptomer er utfordrende fordi den deler vektorer, Geografisk fordeling og symptomer med Dengue og Chikungunya virus infeksjon1. Gitt risikoen for uønskede svangerskap resultater i kvinner er smittet med ZIKV under graviditet, er det viktig å skille mellom 3 virus. Selv om gjeldende molekylær Diagnosetestene er bestemt, er de bare nyttig i blod eller spytt i løpet av relativt kort perioden akutt infeksjon2,3. Serologisk analyser er avgjørende for diagnosen utenfor denne første perioden av smitte4.
Utviklingen av en ZIKV bestemt serologisk analysen er utfordrende for to grunner: først Zika antigener som menneskets immunsystem reagerer ikke for øyeblikket kjent; og andre, konserverte flaviviruses amino acid sekvenser indusere antistoff kryssreaktivitet. Vårt mål var å oppdage unike ZIKV bestemt peptider som skal brukes i diagnostikk. Ulike tilnærminger har blitt utviklet til skjermen peptid biblioteker som dekker hele proteiner inkludert phage, bakteriell og gjær overflate vise5,6,7,8,9, 10. Vår strategi var å bruke en høy tetthet peptid microarray som tillater rask og rimelig høy gjennomstrømming serologisk screenings11,12 og senere identifisert peptidene kan brukes til å forbedre gjeldende serologisk analyser for gjenkjenning av ZIKV.
Denne protokollen kan oppdagelsen av Zika virus spesifikke diagnostiske peptider ved hjelp av en høy tetthet peptid microarray (figur 1). Høy tetthet peptid microarray er produsert ved hjelp av peptid laserutskrift teknologi. Hele ZIKV protein sekvensen bestående av 3,423 aminosyre rester basert på fransk polynesiske belastningen (GenBank: KJ776791.2), ble trykket på et standard glass lysbilde i blokker av 15 lineær rester med overlapping mellom 14 aminosyre rester i duplikat for en totalt 6,846 peptid flekker. I tillegg til hele Zika protein sekvens peptidene, microarray benytter influensa hemagglutinin (HA) peptider for internkontroll.
En Zika bekreftet positive serum utvalg fra Wadsworth Center (Albany, NY), ble brukt til å identifisere bestemte immunglobulin M (IgM) og immunglobulin G (IgG) reaktive peptider. Etter rugende med eksempelet over natten, var microarray farget med en sekundær fluorochrome konjugert antistoff (anti-menneskelige IgM eller anti-menneskelige IgG) og analysert på en microarray skanner. Kvantifisering av spot intensitet og peptid merknader ble utført med spesifikk programvare levert av samme firma som produserte microarray.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utviklet en protokoll som bruker en høy tetthet peptid microarray som inneholder hele Zika virus protein sekvensen (fransk polynesiske belastning). Microarray ble produsert av utskrift 3,423 ulike overlappende lineær peptider. Hver peptid var 15 aminosyrer og variert med bare én rester fra sin nærmeste nabo i rekkefølge (dvs., 14 rester overlapping). Selv om kortere overlapper kan skrives, er epitope kartlegging mer nøyaktig med lengre overlapper. Hver peptid ble trykt i duplikat for økt stabilitet.</p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dagens støtte er levert av en SBIR (Small Business Innovation Research) administrative supplement tilskudd fra NIDCRR44 DE024456. NIDCR HIV grant som utviklet seg ut av NIDCR gi U01 DE017855 for utvikling av en bekreftende point-of-care diagnose for HIV. Vi erkjenner takknemlig Silke Weisenburger(PEPperPRINT Heidelberg, Germany) for hennes kundestøtte og vennlig støtte. Vi takker også NYU Langone Medical Center for LI-COR Odyssey Imaging System.
Materials
| PEPperCHIP Custom Peptide Microarray | PEPperPRINT | PPC.001.001 | Custom peptide micarray: our microarray contains the entire Zika virus protein sequence |
| PEPperCHIP incubation tray 3/1 | PEPperPRINT | PPC.004.001 | |
| PEPperCHIP Staining Kit (680 nm) (anti-HA, DyLight labeling) | PEPperPRINT | PPC.037.002 | |
| PepSLide Analyzer | PEPperPRINT | PSA.004.001 | 14-days free License for Windows |
| Rockland Blocking buffer | Rockland | MB-070 | |
| anti-human IgM (mu chain) DyLight 800 | Rockland | 609-145-007 | |
| anti-human IgG Fc DyLight 680 | Thermo Scientific | SA5-10138 | |
| LI-COR Odyssey Imaging System | LI-COR | ||
| Orbital shaker device | IKA | MTS 2/4 digital microtiter shaker | |
| Adobe Illustrator | Adobe | ||
| Deltagraph | Redrocks |
Referências
- Kelser, E. A. Meet dengue’s cousin. Zika. Microbes Infect. 18 (3), 163-166 (2016).
- Musso, D., et al. Detection of Zika virus in saliva. J Clin Virol. 68, 53-55 (2015).
- Siqueira, W. L., et al. Oral Clinical Manifestations of Patients Infected with Zika Virus. Oral Health. , (2016).
- Duarte, G. Challenges of Zika Virus Infection in Pregnant Women. Rev Bras Ginecol Obstet. 38 (6), 263-265 (2016).
- Buus, S., et al. High-resolution mapping of linear antibody epitopes using ultrahigh-density peptide microarrays. Mol Cell Proteomics. 11 (12), 1790-1800 (2012).
- Kouzmitcheva, G. A., Petrenko, V. A., Smith, G. P. Identifying diagnostic peptides for lyme disease through epitope discovery. Clin Diagn Lab Immunol. 8 (1), 150-160 (2001).
- Hamby, C. V., Llibre, M., Utpat, S., Wormser, G. P. Use of Peptide library screening to detect a previously unknown linear diagnostic epitope: proof of principle by use of lyme disease sera. Clin Diagn Lab Immunol. 12 (7), 801-807 (2005).
- t Hoen, P. A., et al. Phage display screening without repetitious selection rounds. Anal Biochem. 421 (2), 622-631 (2012).
- Townend, J. E., Tavassoli, A. Traceless Production of Cyclic Peptide Libraries in E. coli. ACS Chem Biol. 11 (6), 1624-1630 (2016).
- Turchetto, J., et al. High-throughput expression of animal venom toxins in Escherichia coli to generate a large library of oxidized disulphide-reticulated peptides for drug discovery. Microbial Cell Factories. 16 (1), 6 (2017).
- Carmona, S. J., Sartor, P. A., Leguizamon, M. S., Campetella, O. E., Aguero, F. Diagnostic Peptide Discovery: Prioritization of Pathogen Diagnostic Markers Using Multiple Features. Plos One. 7 (12), e50748 (2012).
- Lagatie, O., Van Dorst, B., Stuyver, L. J. Identification of three immunodominant motifs with atypical isotype profile scattered over the Onchocerca volvulus proteome. PLoS Negl Trop Dis. 11 (1), e0005330 (2017).
- Basile, A. J. Development and validation of an ELISA kit (YF MAC-HD) to detect IgM to yellow fever virus. J Virol Methods. 225, 41-48 (2015).
- Madden, T. The BLAST Sequence Analysis Tool. The NCBI Handbook. , (2013).
- Services, U. S. D. o. H. a. H. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Pellois, J. P., et al. Individually addressable parallel peptide synthesis on microchips. Nat Biotech. 20 (9), 922-926 (2002).
- Stafford, P., et al. Physical Characterization of the “Immunosignaturing Effect”. Mol Cell Proteomics. 11 (4), (2012).
- Gardner, T. J., et al. Functional screening for anti-CMV biologics identifies a broadly neutralizing epitope of an essential envelope protein. Nat Commun. 7, (2016).
- Nixon, C. E., et al. Identification of protective B-cell epitopes within the novel malaria vaccine candidate P. falciparum Schizont Egress Antigen-1. Clin Vaccine Immunol. , (2017).
