Bu makalede nasıl fare embriyonik arka beyin bir model olarak tüm organ ve doku bölümü hazırlıklar gelişimsel neurogenesis eğitimi için kullanılabileceğini gösterir.
Fare embriyo ön memeli neurogenesis geliştirme sırasında çalışmak için en çok çalışan bir sistemdir. Ancak, son derece katlanmış ön neuroepithelium organ genelindeki neurogenesis modellerini incelemek için wholemount analiz için müsait değildir. Ayrıca, ön neurogenesis mekanizmaları tanımlama mutlaka neurogenesis beynin diğer bölümlerinde akıllı değildir; Örneğin, ön özgü progenitör alt türlerinden varlığı nedeniyle. Fare arka beyin wholemount analiz yanı sıra doku bölümler kronolojik zamanmekansal dağıtım ve sinirsel ataları davranışını gözlemlemek için mükellef embriyonik neurogenesis eğitim için alternatif bir model sağlar. Ayrıca, kolayca hücre izolasyon ya da moleküler biyoloji analiz gibi aşağı akım diğer uygulamalar için kesmiştim. Fare arka beyin kolayca çok sayıda hücre lineage muhabir ve kullanılabilir hale gelmiştir mutant fare suşları için analiz edilebilir gibi bir memeli gelişimsel neurogenesis hücresel ve moleküler mekanizmaları çalışmak için güçlü bir model sunuyor organizma. Burada, fare embriyo arka beyin wholemount hazırlıkları ve doku bölümleri memeli nöral progenitör hücre (NPC) davranışını analiz etmek için kullanmak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.
Embriyonik memeli geliştirme sırasında ventrikül (VZ) ve subventricular (SVZ) bölgeleri genişleyen neuroepithelium ‘neurogenesis’ olarak adlandırılan bir süreç içinde yeni sinir hücreleri oluşturmak için NPCs bölün. Daha az diğer bölgelerde bu işlem hakkında bilinen iken üretimi kendi NPC öncüleri ve yeni nöronlar ön1‘ de, kapsamlı soruşturma.
Ön anlama neurogenesis desenler arasında tüm organ zorlu yapan histolojik yöntemlerle doku kesit sonra büyük ölçüde okudu bir karmaşık ve girift katlanmış yapısıdır. Ayrıca, ön neurogenesis çalışmaların diğer beyin bölgeleri veya spinal kord Nörojenik davranışının mutlaka akıllı değildir. Örneğin, farklı CNS bölgeler arasında farklı yanıt Temin ipuçlarını gibi silier Nörotrofik faktör ve lösemi inhibitör faktörü söz konusu olduğunda sinyal, hangi kendini-NPCs yenilenmesi yanal ganglionic Hazretleri, ancak sürücü teşvik spinal kord ataları2farklılaşma. Ayrıca, gelişmekte olan ön doldurmak ve serebral korteks1 genişlemesi için önemli ölçüde katkıda NPCs bir alt sınıfı yok arka beyin ve omurilik3. Ters, spinal kord ve arka beyin korteks yok alternatif NPC alt türlerini içeren akla yatkın.
Fare embriyo arka beyin memeli beynin evrimsel en eski bölgesi ve serebellum ve beyin sapı oluşturur. Türler arasında onun koruma rağmen nispeten az NPC alt türlerinden veya kendi mevzuatı da dahil olmak üzere arka beyin neurogenesis hakkında bilinir. Arka beyin araştırma fare çoğunluğu doku segmentasyon, Hox genleri4ve sonrası Mitotik nöronlar5desenlendirme tarafından tahrik işlem üzerinde odaklanmıştır. Buna ek olarak, arka beyin bir model olarak gelişimsel angiogenez6mekanizmaları eğitim için kullanılmıştır.
Fare arka beyin aksine, Zebra balığı arka beyin yoğun NPC farklılaşma ve omurgalı model organizma (örneğin,7,8) ilerlemesinde soy takip etmek kullanılmıştır. Piliç arka beyin aynı zamanda omurgalı geliştirme sırasında (örneğin,9,10) neurogenesis çalışmaya istihdam edilmiştir. Zebra balığı arka beyin11benzer, piliç arka beyin NPC davranış ve yönetmelik saat12üzerinde çalışmaya görüntülü canlı olabilir. Çünkü onlar geliştirmek yanında canlı düşsel benzer boyuna gözlem memeli canlılar arasında şu anda mümkün değildir rahimde. Ayrıca, manipülasyon teknikleri ile elektroporasyon kolayca evrimleşmiş Zebra balığı embriyo veya civciv embriyo ovo içinde (örneğin,13) için uygulanabilir, ama böyle teknikleri de daha içinde zor gibi hedef Rahim.
Yine de, fare embriyo arka beyin zarif neurogenesis yöneten moleküler ve hücresel mekanizmaları tanımlamak için uygundur. İlk olarak, fare arka beyin analizini birçok durumda daha insanlar gelişmeler için bundan daha düşük omurgalılar eğitim yoluyla elde edilen ilgili bilgi sağlar. Ayrıca, çok sayıda genetiği değiştirilmiş fare suşları kullanılabilir ya kader fare NPCs eşleme için veya düzenleyici mekanizmaları ile ilgili genlerin kurucu veya koşullu mutant gen değiştirmek için kullanılabilir. Son olarak, bu son zamanlarda o mikroenjeksiyon gösterilmiştir ventrikül arka beyin ataları ex vivo arka beyin NPC Kinetik14kısa en az bir inceleme sağlar. Henüz, şu anda çok az arka beyin NPCs bütün organ bağlamda davranışını ve kronolojik zamanmekansal organizasyon hakkında bilinir.
Burada, biz arka beyin wholemount hazırlıkları ve doku bölümleri memeli NPC davranışını analiz etmek için güçlü bir model olarak kullanmak için basit ve hızlı bir yöntem göstermek. Daha fazla immunolabeling farklı neurogenesis parametreleri eğitim süreci arka beyin örnekleri daha fazla nicel transkriptaz (qRT) gibi aşağı akım moleküler uygulamalar için kullanılacak iletişim kurallarını sağlamak-PCR.
Bu iletişim kuralı, gelişimsel neurogenesis mekanizmaları incelemek için bir model olarak fare embriyonik arka beyin kullanmayı açıklamaktadır. Farklı immunolabeling yöntemler kullanarak, arka beyin NPCs görüntülenmeyecektir ve doku bölümleri veya organ wholemounts genelinde sayıları sayılabilir. Arka beyin organ çapında neurogenesis kalıpları üzerinde bilgi toplamak için bir ‘açık kitap’ hazırlık görüntüsü diseksiyon ve düz anatomi kolaylığı sağlar.
Biz daha fazla NPC morfoloji ve hücre döngüsü ile ilgili NPC konumlandırma kolayca içinde yüzen görüntülenmeyecektir olduğunu gösterir-ya da arka beyin cryosections. Her iki davranış daha önce memeli telencephalon20dakika sonra gerçekleştirilen gibi yeni yaratıcı nüfus, tanımlamak için istismar. Örneğin, erken oluşan Sox2+ neuroepithelia ve Pax6+ apikal Radyal glia arka beyin21,22‘ var, ancak arka beyin Tbr2+ Bazal ataları3 eksik .
Burada açıklanan protokolü de floresan canlı görüntüleme ve/veya sabit dokularda soy izleme için etiketleme tarafından özel NPC altgrupları davranışlarını gözlemlemek için adapte edilebilir. Bu, örneğin, hindbrains üzerinden tamoxifen indüklenebilir Sox1-iCreERT2 transgene ve Rosa26tdTomato muhabir23taşıyan fareler inceleyerek elde edilebilir.
Arka beyin daha fazla benzer olması beklenen son derece korunmuş beyin bölgesi olduğu için fare neurogenesis bilgisine artırmanın yanı sıra, arka beyin eğitim türler arasında paylaşılır geniş ilgili Nörojenik mekanizmaları aydınlatmak ön daha omurgalı türler arasında.
Arka beyin neurogenesis ön neurogenesis23daha nispeten daha kısa bir zaman penceresi üzerinden gerçekleşir gibi yeterince karşılaştırmak için ihtiyaç embriyo sahnelenen dikkate almak önemlidir. Buna göre deneysel önyargı sayma ve onun arka beyin izole önce bir embriyo somite çiftlerinin sayısı kayıt tarafından önlenmiş olur. Arka beyin doku kırılgandır ve forseps bu nedenle dikkatli bir şekilde baş Mezenşim ve meninkslerde arka beyin doku ayıran zaman ele alınmalıdır; değerli embriyo diseksiyon çalıştı önce ‘uygulama çalışan’ bir çift bu nedenle tavsiye olabilir. Ayrıca, hindbrains bir tüp sizden bir geniş-geçişli Pasteur pipet kullanarak başka bir yerine (pipet’ın açılış genişlemiş ucu kesme tarafından temiz makasla) zarar görmemesi için Forseps ile aktarılmalıdır. Son olarak, her ne kadar nadir, S-faz NPCs içine EdU/BrdU şirketleşme ölçüde değişken, özellikle kısa (Yani, 1 h) darbeleri sırasında olabilir. Etiketleme artırmak için çözüm şırınga yüklemeden önce EdU/BrdU düzgün çözünmüş emin olun ve dikkatle Periton boşluğuna enjekte. Bu subkutan kaza ile yaptığı gibi zavallı enjeksiyonları kaybetme veya EdU/BrdU çözüm bindirme neden ve dolaşımı girmesini önlemek.
The authors have nothing to disclose.
Vasiliki Chantzara zamanlı matings ve fare yetiştiriciliği için Oftalmoloji UCL Enstitüsü biyolojik kaynak birimi personeli dışarı taşımak için teşekkür ediyoruz. Bu çalışmada Wellcome güven Araştırmacı Ödülü 095623/Z/11/Z CR tarafından desteklenmiştir.
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
Mowiol | Millipore | 475904 | |
OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
Thermometer | VWR | 620-0858 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |