Эта рукопись описывает, как разрез как поражения на искусственный эпителиальных клеток монослои удобно модель раны исцеления в пробирке, позволяя для воображения, конфокальная или лазерная сканирующая микроскопия, и которые могут обеспечить высокое качество количественные и качественные данные для изучения поведения клеток и механизмы, участвующие в миграции.
Миграции клеток является обязательным аспектом для заживления ран. Создание искусственных раны на животных моделях исследования часто приводит к дорогостоящим и сложным экспериментальных процедур, хотя потенциально не хватает точности. В vitro культуры эпителиальных клеточных линий обеспечивает подходящую платформу для исследования миграционных поведение ячейки в заживлении ран и влияние лечения на эти клетки. Физиологии эпителиальных клеток часто изучаются в условиях не притока; Однако этот подход может не напоминают природные условия заживления. Нарушения целостности эпителия механическими средствами создает реалистичной модели, но могут препятствовать применению молекулярных методов. Следовательно, микроскопии основанные методы являются оптимальными для изучения миграции эпителиальных клеток в пробирке. Здесь мы подробно два конкретных методов, искусственного рану скретч пробирного и Фронт assay искусственных миграции, который может получить количественные и качественные данные, соответственно, на мигрирующих производительность эпителиальных клеток.
Клетки миграции необходим для заживления ран, как он несет ответственность за окончательное закрытие эпителиальных разрыва и восстановлению нарушенных поверхности1. Выполнение искусственных раны в животных моделях позволяет для репликации этого сложного процесса в физиологических условиях2. Однако этот подход часто приводит к дорогостоящим и сложным экспериментальных процедур, которые потенциально не хватает точности для изучения различных процессов, из-за сложного характера процесса заживления раны.
В vitro культуры эпителиальных клеточных линий обеспечивает полезной альтернативой животных моделей для изучения роли, которую эти клетки играют в заживлении ран и эффекты лечения на мигрирующих поведение клеток. Физиологии эпителиальных клеток часто изучаются на молекулярных методов с использованием не притока культур3,4,5,6; Однако нарушение целостности эпителия обычно достигается тонкой механической разрезов. В культуре клеток это означает, что незначительное количество клеток могут быть подвержены разрыва раны, и они представляют собой образец слишком мал для методы молекулярной биологии. Однако эти поражения могут быть изучены в микроскопических масштабе, воспользовавшись врожденной мигрирующих свойств некоторых эпителиальных клеток линий, например норки легких эпителиальных клеток (Mv1Lu) или клеток кератиноцитов спонтанно увековечен человека (HaCaT) линии.
Здесь мы описали метод для микроскопии, которая подходит для получения количественных данных о миграции эпителиальных клеток в контексте заживления3,4,,78. Кроме того мы представляем дополнительные методы, которые будут полезны для изучения качественно молекулярных и морфологических изменений, происходящих на эпителиальные монослои во время миграции. В целом эти методы предоставляют основу для изучения динамики и морфологических изменений, связанных с поведением эпителиальных клеток и ответ на лечение во время заживления ран.
После кожи или слизистой нарушения барьер функция восстанавливается действиями многочисленных типов клеток, включая фибробластов или иммунной и эпителиальных клеток. Слитно, эти клетки проходят комплекс процесса с участием апоптоза, распространения, дифференциация и главное, фиброб…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотим дать благодаря пожилых членов лаборатории, которые помогают улучшить и совершенствовать эти методы в фактическое состояние: д -р Селия Мартинес-Мора; Д-р Анна Mrowiec, доктор Catalina Руис Каньяда и доктор Antonia Alcaraz Гарсия. Мы в долгу перед Clínico больница Университарио Virgen де ла Arrixaca для решительно поддержал разработку этих методов. Также Институт де Salud Карлоса III, Fondo de Investigaciones Sanitarias. План Estatal I + D + I и y Salud Карлоса III-главное Генеральной де исследования де Instituto фоменто де ла Investigación (Грант №: ПЭ13/00794); www.isciii.ES. Fondos ФЕДЕР «hacer Una manera de Europa». Мы также благодарим Universidad de Murcia, Суммирующий-Arrixaca и FFIS для административной поддержки и помощи. Наконец, мы хотим дать отдельное спасибо доктор Изабель Мартинес-Argudo и латиноамериканского факультета de Ciencias y Ambientales Bioquímica, кампус парке де-ла-де-Армас завод, Universidad Кастилья Ла Манча, Толедо за их поддержку в охотно цедирование Биомедицины и биотехнологии лабораторию, чтобы сделать возможным снят частью этой бумаги.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Biowest, Nuaillé, France | L0102-500 | Optional 10 % FBS supplement |
Eagles’s Minimum Essential Medium (EMEM) | Lonza | BE12 -662F | Optional 10 % FBS supplement |
L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | Use at 2 mM |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA | DE17603A | |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T4049 | Dilute as appropriate |
Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | P9155 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x) | Gibco by Life Technologies | 14200-067 | Dilute to 1x |
24-well culture plates | BD FALCON//SARSTED | 734-0020 | |
6-well culture plates | SARSTEDT | 83-3920 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | E9644 | Used 10 ng/mL |
Round cover glass | MENZEL-GLÄSER | MENZCB00120RA020 | SHORT DEPTH OF FIELD |
Reinforced razor blade no. 743 | Martor (through VWR) | MARO743.50 | |
200 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0541 | |
20 µl sterile aerosol pipet tips | VWR | 732-0528 | |
Digital camera coupled phase contrast microscope | Motic Spain | Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31 | |
Confocal microscope | ZEISS Microimaging, Germany | LSM 510 META | |
10 cm Culture dish | BD FALCON | 353003 | |
Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1694 | Used 1:100 |
Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488 | Invitrogen | A11008 | Used 1:400 |
Hoechst-33258 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | 14530 | Used 1:1000 |
Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red) | Invitrogen | A12381 | Used 1:100 |
Bovine Serum Albumin | Santa Cruz Biotechnology | SC-2323 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA | T9284 | |
Skim milk | BD DIFCO | 232100 | |
ImageJ | National Institutes of Health, USA | Release 1.50i | |
Zen LSM 510 image processing software | ZEISS Microimaging, Germany | Release 5.0 SP 1.1 |