Med fluorescens In Situ hybridisering (FISH) för att övervaka tillståndet för Arm sammanhållning i metafasen och metafas I Drosophila oocyter
Summary
Detta manuskript presenterar en detaljerad metod för att generera X-kromosom arm sonder och utför fluorescens i situ hybridisering (FISH) att undersöka tillståndet i syster kromatida sammanhållning i metafasen och metafas jag arresterad Drosophila oocyter. Detta protokoll är lämplig för att avgöra om meiotiska arm sammanhållning är intakt eller störd i olika genotyper.
Abstract
I människor ansvarar kromosom segregation fel i oocyter för majoriteten av missfall och missbildningar. Dessutom som kvinnor ålder, är risken att bli gravid en aneuploid fostret ökar dramatiskt och detta fenomen kallas moderns ålderseffekt. Ett krav för korrekt kromosomsegregering under meiotiska divisionerna är underhåll av syster kromatida sammanhållning under perioden utökade profas som oocyter erfarenhet. Cytologiska bevis hos både människor och modellorganismer tyder på att meiotiska sammanhållning försämras under åldrandeprocessen. Dessutom segregation fel i mänskliga äggceller är vanligast under meios I, överensstämmer med tidig förlust av arm sammanhållning. Användning av modellorganismer är avgörande för att nysta upp de mekanismer som ligger bakom åldersberoende förlust av sammanhållning. Drosophila melanogaster erbjuder flera fördelar för att studera regleringen av meiotiska sammanhållning i oocyter. Tills nyligen var dock bara genetiska tester tillgängliga till assay för förlust av arm sammanhållning i oocyter av olika genotyper eller olika experimentella villkor. Här är ett detaljerat protokoll förutsatt för att använda fluorescens i situ hybridisering (FISH) att direkt visualisera defekter i arm sammanhållning i metafasen jag och metafas jag arresterad Drosophila oocyter. Genom att generera en fisk sond som hybridizes till distala armen av X -kromosomen och samla confocal Z stackar, forskare kan visualisera antalet enskilda fisk signaler i tre dimensioner och avgöra om syster kromatida armar är separerade. Förfarandet gör det möjligt att kvantifiera arm sammanhållning defekter i hundratals Drosophila oocyter. Som sådan, ger denna metoden ett viktigt verktyg för att undersöka de mekanismer som bidrar till sammanhållningen underhåll samt de faktorer som leder till dess undergång under åldrandeprocessen.
Introduction
Ordentlig segregation av kromosomerna under Mitos och meios kräver att syster kromatida sammanhållningen vara etablerade, underhålls och släppt i ett samordnat1,2. Sammanhållning är etablerad under S-fasen och medieras av den cohesin komplex, som utgör fysiska kopplingar som håller syster kromatiderna grupp. I meios, sammanhållning distalt en crossover fungerar även för att hålla rekombinant homologs ihop och detta Läkarundersökninganslutning säkerställer rätt orientering av bivalent på metaphasen jag spindel (figur 1)3,4, 5. Release av arm sammanhållning på Anaphasen jag tillåter homologs att segregera till motsatta spindeln poler. Förlora sin fysiska anslutningen dock om arm sammanhållning är förlorade tidigt, rekombinant homologs kommer att och segregera slumpmässigt, vilket kan resultera i aneuploid könsceller (figur 1).
I mänskliga äggceller, fel i kromosomsegregering är den vanligaste orsaken till missfall och missbildningar, till exempel Downs syndrom6, och deras förekomst ökar exponentiellt med moderns ålder7. Syster kromatida sammanhållning är etablerat i fostrets oocyter och meiotisk rekombination är klar före födseln. Oocyter sedan gripa i mitten av profas jag tills ägglossning och under denna gripande, den fortsatta fysiska anslutningen av rekombinant homologs bygger på syster kromatida sammanhållning. Därför kräver korrekt segregation under meios och normala graviditeter att sammanhållning förblir intakt i upp till fem decennier.
För tidig förlust av sammanhållning under långvarig meiotiska gripandet av mänskliga äggceller har föreslagits bidra till moderns ålder effekten och flera rader av bevis som stöder denna hypotes8,9. Men med tanke på utmaningarna som studerar meiotiska sammanhållning i mänskliga äggceller, mycket av vår förståelse av fenomenet bygger på användning av modell organismer5,10,11,12, 13,14,15.
Drosophila melanogaster oocyter erbjuder många fördelar för studiet av meiotiska sammanhållning och kromosom segregering. En enkel genetisk analys gör att man kan återhämta sig avkomma från aneuploid könsceller och mäta trohet av X-kromosomsegregering på en stor skala11,16,17. Dessutom kan man också bestämma huruvida kromosom segregation fel uppstå eftersom rekombinant homologs missegregate under meios I, en fenotyp som överensstämmer med tidig förlust av arm sammanhållning11,18, 19. direkt observation av meiotiska sammanhållning i Drosophila oocyter är också möjligt med hjälp av fluorescens i situ hybridisering (FISH). Även om fluorescerande oligonukleotider som hybridiserar till repetitiva satellit sekvenser har använts i över ett decennium för att övervaka pericentromeric sammanhållning i mogen Drosophila oocyter4,20, analys av arm sammanhållningspolitiken har varit mycket mer utmanande. Visualisering av arm sammanhållning kräver en sond som sträcker sig över en stor region för exemplar sekvenser och är tillräckligt ljust för att leda till synliga signaler för enskilda syster kromatiderna när arm sammanhållning är frånvarande. Dessutom måste äggcellen fixering villkor och storleken på de märkta utsedda nationella myndigheterna underlätta penetration21 in i den stora mogna Drosophila äggcellen (200 µm breda av 500 µm lång). Nyligen, en arm sonden var framgångsrikt utnyttjat att visualisera Drosophila äggcellen kromatiderna under Anaphasen jag, men författarna uppgav att de inte kunde upptäcka en signal i metafasen eller metafas jag arresterad oocyter22. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för generering av X-kromosomen arm fisk sonder och äggcell förberedelse villkor som har låtit oss till assay för tidig förlust av syster kromatida sammanhållning i metafasen jag och metafas jag oocyter. Dessa tekniker, vilket har gjort det möjligt för oss att identifiera genprodukter som krävs för underhåll av meiotiska sammanhållning, kommer att tillåta andra till assay för syster kromatida sammanhållning defekter i mogen Drosophila oocyter från olika genotyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
Användningen av fisk sonder för att bedöma tillståndet för arm sammanhållning i metafasen jag och metafas I Drosophila oocyter är ett betydande framsteg i fältet av Drosophila meios. Historiskt har har Drosophila forskare varit begränsad till genetiska tester för att härleda tidig förlust av arm sammanhållning i mogna äggceller11,18,19. Nu, med de metoder som presenteras här, delstaten a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH Grant GM59354 tilldelas Sharon E. Bickel. Vi tackar Huy Q. Nguyen för hjälp för att utveckla protokollet för att generera fluorescerande arm sonder, Ann Lavanway för hjälp med konfokalmikroskopi och J. Emiliano Reed för tekniskt bistånd. Vi tackar också många kollegor i Drosophila gemenskapen för bra diskussioner och rådgivning.
Materials
| Kits | |||
| Midi Prep kit | Qiagen | 12143 | Prep BAC clone DNA |
| GenomePlex Complete Whole Genome Amplification (WGA) Kit | Sigma | WGA2 | Amplify BAC clone DNA |
| ARES Alexa Fluor 647 DNA labeling kit | Invitrogen | A21676 | Label BAC clone DNA |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Remove non-conjugated dye following labeling of BAC clone DNA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals & Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | Prepare 10% stock Freeze aliquots |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C75-500 | |
| DAPI (4’, 6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 100µg/ml stock in 100% ethanol, store in aliquots at -20 °C. Prepare 1 µg/ml solution in 2X SSCT before use. |
| Dextran sulfate | Sigma | D-8906 | |
| Drierite | Drierite Company | 23001 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Invitrogen | 15508-013 | Prepare 10 mM stock |
| dTTP (10 µmol, 100 µl) | Boehringer Mannheim | 1277049 | Prepare 1 mM stock |
| EDTA (Disodium ethylenediamine tetraacetic acid) | Fisher Scientific | S311-500 | Prepare 250 mM stock |
| 100% ethanol (molecular grade, 200 proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
| Tris (Ultra Pure) | Invitrogen | 15504-020 | |
| EGTA (Ethylenebis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid) | Sigma | E-3889 | |
| 16% formaldehyde | Ted Pella, Inc. | 18505 | Toxic: wear appropriate protection |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | Toxic: wear appropriate protection |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Glycogen | Roche | 901393 | |
| HEPES | Boehringer Mannheim | 737-151 | |
| Heptane | Fisher Scientific | H350-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydrochloric acid | Millipore | HX0603-4 | Toxic: wear appropriate protection. |
| Hydroxylamine | Sigma | 438227 | Prepare 3 M stock |
| 4.9 M Magnesium chloride | Sigma | 104-20 | |
| Na2HPO4 Ÿ 7H2O | Fisher Scientific | S373-500 | |
| NaH2PO4 Ÿ 2H2O | Fisher Scientific | S369-500 | |
| Poly-L-lysine (0.1mg/ml) | Sigma | P8920-100 | |
| Potassium acetate | Fisher Scientific | BP364-500 | |
| Sodium acetate | Fisher Scientific | S209-500 | Prepare 3M stock |
| Sodium cacodylate | Polysciences, Inc. | 1131 | Toxic: wear appropriate protection. Prepare 400mM stock |
| Sodium citrate | Fisher Scientific | BP327-1 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-3 | Sodium chloride |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| 10% Tween 20 | Thermo Scientific | 28320 | Surfact-Amps |
| 10% Triton X-100 | Thermo Scientific | 28314 | Surfact-Amps |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Note: All solutions are prepared using sterile ultrapure water and should be sterilized either by autoclave or filter sterilization. | |||
| TE buffer | 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH = 8.0 | ||
| 20X SSC (Saline Sodium Citrate) | 3 M NaCl, 300 mM sodium citrate | ||
| 2X cacodylate fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 200 mM sodium cacodylate, 200 mM sucrose, 80 mM sodium acetate, 20 mM EGTA | ||
| 1.1X Hybridization buffer | 3.3X SSC, 55% formamide, 11% dextran sulfate | ||
| Fix solution | Toxic: wear appropriate protection. 4% formaldehyde, 1X cacodylate fix solution | ||
| PBSBTx | 1X PBS, 0.5% BSA, 0.1% Trition X-100 | ||
| PBSTx | 1X PBS, 1% Trition X-100 | ||
| Extraction buffer (PBSTx + Rnase) | 1X PBS, 1% Trition X-100, 100 µg/mL RNase | ||
| 2X SSCT | 2X SSC, 0.1% Tween 20 | ||
| 2X SSCT + 20% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 20% formamide | ||
| 2X SSCT + 40% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 40% formamide | ||
| 2X SSCT + 50% formamide | Toxic: wear appropriate protection. 2X SSC, 0.1% Tween 20, 50% formamide | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzymes | |||
| AluI | New England Biolabs | R0137S | |
| HaeIII | New England Biolabs | R0108S | |
| MseI | New England Biolabs | R0525S | |
| MspI | New England Biolabs | R0106S | |
| RsaI | New England Biolabs | R0167S | |
| BfuCI | New England Biolabs | R0636S | |
| 100X BSA | New England Biolabs | Comes with NEB enzymes | |
| 10X NEB buffer #2 | New England Biolabs | Restriction enzyme digestion buffer. Comes with NEB enzymes | |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) 400 U/µl | Roche/Sigma | 3333566001 | |
| TdT buffer | Roche/Sigma | Comes with TdT enzyme | |
| Cobalt chloride | Roche/Sigma | Toxic: wear appropriate protection. Comes with TdT enzyme | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo-Scientific | EN0531 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cytology Tools etc. | |||
| Forceps | Dumont | #5 INOX, Biologie | |
| 9” Disposable glass Pasteur pipettes | Fisher | 13-678-20C | Autoclave to sterilize |
| Shallow glass dissecting dish | Custom made | ||
| Deep well dish (3 wells) | Pyrex | 7223-34 | |
| Fisherfinest Premium microscope slides | Fisher Scientific | 22-038-104 | Used to cover deep well dishes |
| Frosted glass slides, 25 x 75 mm | VWR Scientific | 48312-002 | |
| Glass slides, 3 x 1 in, 1 mm thick | Thermo-Scientific | 3051 | |
| Coverslips, 10 x 10 mm, No. 1.5 | Thermo-Scientific | 3405 | |
| Tungsten needle | homemade | ||
| Prolong GOLD mounting media | Molecular Probes | P36930 | |
| Compressed-air in can | Various | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR machine | Various | ||
| Nanodrop 2000, spectrophotometer | Thermo-Scientific | microvolume spectrophotometer | |
| Vortexer | Various | ||
| Table top microfuge at room temperature | Various | ||
| Table top microfuge at 4 °C | Various | ||
| Heat block | Various | ||
| Hybridization oven or incubator with rotator | Various | ||
| Nutator | Various | ||
| A1RSi laser scanning confoal | Nikon | 40X oil Plan Fluor DIC (NA 1.3) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables etc. | |||
| 50 mL conical tubes | Various | ||
| 15 mL conical tubes | Various | ||
| 1.5 mL microfuge tubes | Various | ||
| 500 µl microfuge tubes | Various | ||
| 200 µl PCR tubes | Various | ||
| Plastic container with tight fitting lid | Various | To hold Drierite | |
| Kimwipes | Various | disposable wipes | |
| Parafilm | Various | paraffin film | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Outro | |||
| HPLC purified 5'-labeled oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | Cy3-labeled probes that recognize the 359 bp satellite repeat of the X chromosome | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | PerkinElmer | Version 6.3 |
Referências
- Peters, J. M., Nishiyama, T. Sister chromatid cohesion. CSH Perspect Biol. 4 (11), (2012).
- McNicoll, F., Stevense, M., Jessberger, R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 102, 1-34 (2013).
- Buonomo, S. B., et al. Disjunction of homologous chromosomes in meiosis I depends on proteolytic cleavage of the meiotic cohesin Rec8 by separin. Cell. 103 (3), 387-398 (2000).
- Bickel, S. E., Orr-Weaver, T., Balicky, E. M. The sister-chromatid cohesion protein ORD is required for chiasma maintenance in Drosophila oocytes. Curr. Biol. 12 (11), 925-929 (2002).
- Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1beta-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37 (12), 1351-1355 (2005).
- Freeman, S. B., et al. The National Down Syndrome Project: design and implementation. Public Health Rep. 122 (1), 62-72 (2007).
- Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13 (7), 493-504 (2012).
- Angell, R. R. First-meiotic-division nondisjunction in human oocytes. Am. J. Hum. Genet. 61, 23-32 (1997).
- Tsutsumi, M., et al. Age-related decrease of meiotic cohesins in human oocytes. PLoS One. 9 (5), e96710 (2014).
- Liu, L., Keefe, D. L. Defective cohesin is associated with age-dependent misaligned chromosomes in oocytes. Reprod Biomed Online. 16 (1), 103-112 (2008).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Aging predisposes oocytes to meiotic nondisjunction when the cohesin subunit SMC1 is reduced. PLoS Genet. 4 (11), e1000263 (2008).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr. Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Lister, L. M., et al. Age-related meiotic segregation errors in mammalian oocytes are preceded by depletion of cohesin and Sgo2. Curr. Biol. 20 (17), 1511-1521 (2010).
- Duncan, F. E., et al. Chromosome cohesion decreases in human eggs with advanced maternal age. Aging Cell. 11 (6), 1121-1124 (2012).
- Yun, Y., Lane, S. I., Jones, K. T. Premature dyad separation in meiosis II is the major segregation error with maternal age in mouse oocytes. Development. 141 (1), 199-208 (2014).
- Subramanian, V. V., Bickel, S. E. Heterochromatin-mediated association of achiasmate homologues declines with age when cohesion is compromised. Genética. 181, 1207-1218 (2009).
- Jeffreys, C. A., Burrage, P. S., Bickel, S. E. A model system for increased meiotic nondisjunction in older oocytes. Curr. Biol. 13 (6), 498-503 (2003).
- Weng, K. A., Jeffreys, C. A., Bickel, S. E. Rejuvenation of Meiotic Cohesion in Oocytes during Prophase I Is Required for Chiasma Maintenance and Accurate Chromosome Segregation. PLoS Genetics. 10 (9), e1004607 (2014).
- Perkins, A. T., Das, T. M., Panzera, L. C., Bickel, S. E. Oxidative stress in oocytes during midprophase induces premature loss of cohesion and chromosome segregation errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (44), E6823-E6830 (2016).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation. Cell. 86, 135-146 (1996).
- Dernburg, A. F., Sedat, J. W. . Method Cell Biol. 53, 187-233 (1998).
- Guo, Z., Batiha, O., Bourouh, M., Fifield, E., Swan, A. Role of Securin, Separase and Cohesins in female meiosis and polar body formation in Drosophila. J Cell Sci. 129 (3), 531-542 (2016).
- Giauque, C. C., Bickel, S. E. Heterochromatin-Associated Proteins HP1a and Piwi Collaborate to Maintain the Association of Achiasmate Homologs in Drosophila Oocytes. Genética. 203 (1), 173-189 (2016).
- Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Beliveau, B. J., Wu, C. T. Germline progenitors escape the widespread phenomenon of homolog pairing during Drosophila development. PLoS Genet. 9 (12), e1004013 (2013).
- Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes. Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).
- Gyuricza, M. R., et al. Dynamic and Stable Cohesins Regulate Synaptonemal Complex Assembly and Chromosome Segregation. Curr Biol. 26 (13), 1688-1698 (2016).
- Radford, S. J., McKim, K. S. Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes. J Vis Exp. (116), (2016).
