Utvärdering av stamceller terapier i bilaterala knäskålssenan skada modell hos råttor

Summary

Detta dokument beskriver utarbetande och utvärdering av navelsträngen matrix-derived mesenkymala stamceller spheroids med bilaterala knäskålssenan defekt modell i en råtta. Denna modell var var en godtagbar hälsoförsämring och hittade för att identifiera skillnader mellan obehandlade och behandlade senor, och mellan de två behandlingarna testas.

Abstract

Regenerativ medicin ger romanen alternativ till villkor som utmanar traditionella behandlingar. Prevalens och sjuklighet av tendinopathy mellan arter, har kombinerat med begränsad helande egenskaper av denna vävnad, du uppmanas sökandet för cellulära behandlingar och drivs utvecklingen av experimentella modeller för att studera deras effekt. Navelsträngen matrix-derived mesenkymala stamceller (UCM-MSC) är tilltalande kandidater eftersom de är riklig, lätt att samla, kringgå de etiska farhågor och risk för teratoma bildning, ändå likna primitiva embryonala stamceller närmare än Adult vävnad-derived MSCs. betydande intresse har fokuserat på kitosan som en strategi för att förbättra egenskaperna för MSCs genom sfäroid bildas. Detta papper Detaljer tekniker att isolera UCM-MSCs förbereda spheroids på chitosan film och analysera effekten av sfäroid bildas på ytan markör uttryck. Därför beskrivs skapa en bilaterala knäskålssenan skada modell råttor för i vivo implantation av UCM-MSC spheroids bildas på chitosan film. Inga komplikationer observerades i studien avseende sjuklighet, betona stigande effekter eller vävnad infektion. Funktionella poängsumman av de opererade råttorna på 7 dagar var lägre än för normala råttor, men återgick till det normala inom 28 dagar efter operation. Histologiska noter av vävnad-healing bekräftat förekomsten av en propp i behandlade defekter utvärderade på 7 dagar, frånvaron av främmande kropp reaktion och framåt helande i 28 dagar. Denna bilaterala patella senan defekt modell var styr interindividuell variation via skapandet av en intern kontroll i varje råtta, associerade med acceptabel sjuklighet, och tillät detektering av skillnaderna mellan obehandlade senor och behandlingar.

Introduction

Senan skada är en av de vanligaste orsakerna till betydande smärta och muskel atrofi över arter¹. Inom veterinärmedicinen är senor och ligament skador av särskilt intresse för hästar, som 82% av alla skador i kapplöpningshästar involverar rörelseapparaten, och 46 procent av dem påverkar senor och ligament^2,3. Ärrvävnad bildas påverkar läkta senor biomekaniska egenskaper och förklarar bevakad prognosen för återgång till athletic användning efter flexor sena skador; Re-skadan uppstår inom 2 år i upp till 67% av hästar behandlades konservativt⁴. Regenerativ medicin ger romanen alternativ till ett tillstånd som utmanar traditionella behandlingar. Terapi med autologa stamceller har producerat några uppmuntrande resultat^5,6 men begränsas av den sjuklighet som är associerad med vävnad insamling, fördröjd administrering på grund av bearbetning/omprogrammering av celler och påverkan av den patientens hälsotillstånd (såsom ålder) i egenskaperna för stem cells^7,8. Dessa begränsningar ge en motivering för att utreda allogena stamceller som ett off-the-shelf alternativ. Fostrets adnexa-derived celler är tilltalande kandidater eftersom de kringgå etiska betänkligheter och risk för teratoma bildning förknippas med embryonala stamceller. Bland fostrets adnexa är navelsträngen matrix (UCM), också heter Whartons gelé, riklig och lätt att samla in.

Oavsett cell källa är det nödvändigt att upprätta en cell bank för prövningar regenerativ medicin att förbättra stemness. Ur en funktionell synvinkel, kan stemness definieras som risken för självförnyelse och flera härstamning differentiering⁹. Bevis på stemness beroende proliferation och differentiering analyser, tillsammans med uttrycket av genen markörer Oct4, Sox2, och Nanog⁹. En strategi för att förbättra stemness är beroende av användningen av biomaterial som ogiltiga fyllmedel och bärare ökad proliferation och differentiering av UCM-MSCs. Denna strategi eliminerar oro för manipulation av transkriptionell faktorer att omprogrammera mogna celler i inducerade pluripotenta celler. Bland biomaterial betraktas som potentiella bärare för stamceller, är chitosan tilltalande för sina biokompatibilitet och nedbrytbarhet¹⁰. Detta naturliga aminopolysaccharide bildas av alkaliska deacetylering av chitinen, den näst vanligaste naturliga polysackarid, primärt erhålls som en minimiimportpriserna skaldjur¹⁰. Vi har tidigare undersökt samspelet mellan MSCs och chitosan ställningar, och observerade bildandet av spheroids^{11,12,13,14,15, 16}. vi rapporterade också om överlägsenhet av kondrogenes om chitosan matriser^{12,13,14,15,16,17, 18}. Mer nyligen, två oberoende studier beskrivs spheroids bildandet av fettvävnad och moderkakan vävnad härrör MSCs odlade på en chitosan film^19,20. Denna formation av spheroids inte bara förbättrat stemness, men också förbättrat lagring av stamceller efter i vivo implantation²⁰.

Prevalens och sjuklighet av tendinopathy över arter har föranlett utvecklingen av experimentella modeller för att studera patofysiologin bakom tendinopathies och testa nya terapier såsom stamceller injektioner. Hästar är kollagenas-inducerad tendinit en gemensam modell för att demonstrera effekten använder MSCs i senan reparation²¹. Relevansen av detta tillvägagångssätt är begränsad, eftersom injektioner orsaka akut inflammatoriska förändringar, medan kliniska tendinopathies brukar resultera från kronisk överansträngning^22,23. Dessutom kemisk inducering av senan sjukdom inducerar en helande svar och replikerar inte nedsatt läkningsprocessen närvarande i kliniska fall^22,23. Excision av ett segment av ytliga digitala flexor senan har beskrivits som en kirurgisk modell av tendinit i hästar²⁴. Mer nyligen, användes en minimalt invasiv metod att begränsa de traumatiska skador till den centrala kärnan i de ytliga digitala flexor tendon²⁵. Kirurgiska modeller gör inte simulera den trötthet mekanism som kan leda till naturliga senan sjukdom, och tenderar att saknar reproducerbarhet i omfattningen av skada skapade²⁵. Oavsett modell, sjuklighet och kostnaden i samband med höstdagjämningen modeller av senan finns sjukdomar ytterligare begränsningar, som motiverar ett intresse för gnagare modeller som ett första steg i vivo utvärdering av nya behandlingar.

En av de främsta fördelarna med experimentella modeller hos gnagare består av kostnaden och möjligheten att styra interindividuell variabilitet. Gnagare kan vara standardiserat med avseende på olika fysiologiska faktorer på grund av deras snabba tillväxt och kort relativt livslängd, begränsa källor till variation och därför minska antalet djur som krävs för att upptäcka skillnader. Strategier för att framkalla senan sjukdomar hos gnagare har förlitat sig på kemiska induktion, men också på kirurgiska skapandet av partiell senor defekter²¹. Kirurgiska modeller kan simulera naturlig tendinopathies bättre än kemiska modeller, men kan leda till högre sjuklighet och totalhavererar den skadada senan. I det avseendet verkar råttor bättre kandidater än möss för dessa modeller, eftersom deras storlek tillåter skapandet av större defekter, därigenom underlätta utvärderingen av vävnad healing. Sprague-Dawley-råttor har använts i experimentella studier av tendinopathies i fyra stora senan grupper: rotatorkuffen, flexor, Achilles och patellar senor²⁶. Bland dessa är modeller som innebär att knäskålssenan särskilt tilltalande på grund av den större storleken av denna senan och enkel åtkomst till den²⁷. Knäskålssenan fäster i quadriceps-muskeln vid tibial ischii. Inom denna extensor mekanismen är patella en sesamoid ben som leder handlingen av quadriceps och skisserar proximala omfattningen av knäskålssenan. Förekomsten av beniga ankare på proximala och distala graderna av knäskålssenan underlättar biomekaniska tester. Modeller som involverar knäskålssenan vanligtvis lita på ensidiga kirurgiska defekter, med en kontralateral intakt sena tjänstgör som en kontroll^28,29. Den vanligaste knäskålssenan defekt modellen innebär excising den centrala delen (1 mm i bredd) av knäskålssenan från distala spetsen av knäskålen till införandet av den tibial ischii, medan den kontralaterala knäskålssenan lämnas intakt. Åtgärder av utfall har inkluderat histologi, icke-förstörande biomekanisk testning eller biomekaniska tester till misslyckande, ultraljudsundersökningar, ex vivo fluorescens imaging, brutto observation och funktionella tester^{28,30 ,31}. Unilaterala modeller tillåter inte jämförelse av en föreslagen behandling med konservativ behandling av en liknande skada inom samma djur. Likaså kräver jämförelse mellan flera behandlingar separat djur. En bilaterala modell skulle eliminera Inter-individuella variationer och minska antalet djur som krävs för en studie³². Men bilaterala skador kan öka sjuklighet och bilaterala hälta kunde hindra behandling utvärdering. Ett fåtal studier kort rapportera användning av bilaterala knäskålssenan defekter i råttor men fokus på effekterna av behandlingar i stället för perioperativ hantering och sjuklighet av den modell^33,34.

Denna studie långsiktiga mål är att utveckla en strategi för att förbättra stemness och i vivo överlevnad av UCM-MSCs avsett att prövningar transplantation. För att uppnå detta mål, har vi nyligen rapporterade förbättrad stemness av UCM-MSCs genom bildandet av spheroids på chitosan film och inkubering under hypoxiska miljö³⁵. Dessa in vitro- egenskaper var associerade med förbättrade biomekaniska egenskaper av knäskålssenan defekter behandlas med luftkonditionerade UCM-MSCs. baserat på dessa resultat, råtta bilaterala knäskålssenan defekt modellen verkar lämplig att testa kandidaten behandlingar för sena skador³⁶. Syftet med studien rapporterade här är att ge detaljerade protokoll för isolering och karakterisering av UCM-MSCs, utarbetandet av ett biologiska leveranssystem för stamceller, skapande och behandling av bilaterala patella senan defekter och postoperativ återhämtning och utvärdering av vävnad healing inom defekterna.

Protocol

Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Western University of Health Sciences. 1. isolering och Expansion av MSCs från Equine navelsträngen matris Erhålla moderkakan från en vuxen mare (gravid) efter observerade fölning och aseptiskt isolera navelsträngen från moderkakan. Håll navelsträngen i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 1% penicillin-streptomycin (P/S) vid 4 ° C under överföringen till…

Representative Results

I den aktuella studien presenteras resultat som genomsnitt ± SD (standardavvikelse). Cellerna var isolerade från navelsträngar av 6 ston, och andelen isolerade cellinjer som uttrycker varje cell surface markör under standard eller chitosan luftkonditionering jämfördes med en Friedman test, som en icke-parametrisk variansanalys med upprepade åtgärder. För senan defekt modellskapande, 8 råttor användes för 7 dagar efter operation bedömning och 12 råttor användes för 28 dagar…

Discussion

Equine celler valdes för detta projekt eftersom vi så småningom tänker testa kandidat metoder i hanteringen av naturliga tendinopathies hos hästar. Sena skador hos hästar är verkligen lockande som naturliga modeller av tendinopathy i mannen på grund av biologiska likheten mellan equine ytliga digitala flexor och hälsenan i människor⁴¹. De cell ytmarkörer CD44, CD90, CD105, CD34 och MHC II valdes för immunophenotyping av celler, enligt de kriterier som rekommenderas av den internationel…

Materials

PBS 10X	Hyclone	SH30258.01	Consumable
Collagenase type IA	Worthington	LS004197	Consumable
DMEM low glucose	Hyclone	SH30021.FS	Consumable
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30910.03	Consumable
Penicillin/Streptomycin 100X	Hyclone	SV30010	Consumable
Trypsin 0.25%	Hyclone	SH30042.01	Consumable
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT104	Consumable
Trypan blue	Hyclone	SV30084.01	Consumable
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	Consumable
Chitosan	Sigma	C3646	Consumable
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	Consumable
Bovine Serum Albumin	Hyclone	SH30574.01	Consumable
Round bottom polystyrene tube	Corning	149591A	Consumable
Mouse anti-horse CD44 (FITC)	AbD serotec	MCA1082F	Consumable
Mouse anti-rat CD90 (FITC)	AbD serotec	MCA47FT	Consumable
Mouse anti-horse MHC-II (FITC)	AbD serotec	MCA1085F	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	AbD serotec	MCA928F	Consumable
Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC)	abcam	ab11415	Consumable
Mouse IgG1 (FITC) – Isotype Control	abcam	ab91356	Consumable
Mouse anti-human CD34 (FITC)	BD	BDB560942	Consumable
Mouse IdG1 kappa (FITC)	BD	BDB555748	Consumable
7-AAD	BD	BDB559925	Consumable
BD Accuri C6 Flow Cytometer	BD		Equipment
Vacutainer 5ml	Med Vet International	RED5.0	Consumable
Acid-citrate-dextrose	Sigma	C3821	Consumable
Calcium Chloride	Sigma	C5670	Consumable
Sevoflurane	JD Medical	60307-320-25	Consumable
Rats	Charles River	Strain code: 400	Experimental animal
Rat surgical kit	Harvard apparatus	728942	Equipment
Surgical Blade #15	MEDLINE	MDS15115	Consumable
Rat MD's Baytril (2 mg/Tablet), Rimadyl (2 mg/Tablet)	Bio Serv	F06801	Consumable
Polyglactin 910, 5-0	Ethicon	J436G	Consumable
Eosin alchol shandon	Thermo scientific	6766007	Consumable
Harris Hematoxylin	Thermo scientific	143907	Consumable