Fabricage Procedures en dubbele breking metingen voor het ontwerpen van magnetisch responsieve Lanthanide Ion chelaat fosfolipide Assemblies

Summary

Fabricage procedures voor zeer magnetisch responsieve lanthanide ion chelaat polymolecular assembly’s worden gepresenteerd. De magnetische reactie wordt bepaald door de grootte van de vergadering, die is afgestemd door extrusie via nanopore membranen. De assemblages magnetische alignability en temperatuur-geïnduceerde structurele veranderingen worden gecontroleerd door de dubbele breking metingen, een gratis techniek om nucleaire magnetische resonantie en kleine hoek neutronen verstrooiing.

Abstract

Bicelles zijn afstembare schijf-achtige polymolecular assembly’s gevormd uit een grote verscheidenheid van lipide mengsels. Toepassingen variëren van membraan eiwit structurele studies door nucleaire magnetische resonantie (NMR) tot nanotechnologische ontwikkelingen, met inbegrip van de vorming van optisch actieve en magnetisch schakelbare gels. Dergelijke technologieën vereisen hoge controle van de grootte van de vergadering, de magnetische reactie en de warmteweerstand. Mengsels van 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-fosfocholine (DMPC) en haar lanthanide-ion (Ln^{3 +}) chelaat fosfolipide conjugaat, 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-phospho-ethanolamine-diethyleenglycol triaminepentaacetate () DMPE-DTPA), assembleren in zeer magnetisch responsieve assemblages zoals DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (molaire verhouding 4:1:1) bicelles. Invoering van cholesterol (Chol-OH) en steroïde derivaten in de dubbelgelaagde resultaten in een andere set van assembly’s bieden unieke fysisch-chemische eigenschappen. Voor een bepaald lipide-samenstelling is de magnetische alignability evenredig aan de grootte van de bicelle. De kleurverandering van Ln^{3 +} resulteert in ongekende magnetische reacties in termen van zowel de omvang als de uitlijning richting. De thermo-omkeerbare ineenstorting van de schijf-achtige structuren in blaasjes op verwarming kunt afstemming van de vergaderingen afmetingen door extrusie via membraanfilters met gedefinieerde porie maten. Het magnetisch alignable bicelles worden geregenereerd door afkoeling tot 5 ° C, wat resulteert in vergadering afmetingen gedefinieerd door het blaasje precursoren. Hierin, deze procedure fabricage wordt uitgelegd en de magnetische alignability van de assembly’s wordt gekwantificeerd door dubbele breking metingen onder een 5.5 T magnetisch veld. Het signaal van de dubbele breking, afkomstig uit de fosfolipide dubbelgelaagde, verder kan polymolecular veranderingen in de dubbelgelaagde. Deze eenvoudige techniek is complementair aan NMR experimenten die algemeen werkzaam zijn te karakteriseren van bicelles.

Introduction

Bicelles zijn polymolecular schijf-achtige assemblages verkregen uit talrijke lipide-mengsels. ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} zijn ze veel gebruikt voor de structurele karakterisering van membraan biomoleculen door NMR spectroscopie. ^{6 , 7} echter, recente inspanningen willen uitbreiden op het gebied van mogelijke toepassingen. ^{5 , 8 , 9} de meest bestudeerde bicelle systeem bestaat uit een mengsel van 1,2-dimyristoyl –sn– glycero-3-fosfocholine (DMPC), die deel uitmaken van het vlakke deel van de vergadering en 1,2-dihexanoyl –sn– glycero-3-fosfocholine (DHPC) Fosfolipide die betrekking hebben op de rand. ^{1 , 2 , 3} de moleculaire geometrie van de fosfolipiden componeren het dubbelgelaagde dicteren de architectuur van de structuur van zelf geassembleerde polymolecular. ^{4 , 5} ter vervanging van DHPC met DMPE-DTPA genereert zeer magnetisch responsieve en afstembare bicelle systemen. ^{10 , 11} DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (molaire verhouding 4:1:1) bicelles koppelen met veel meer paramagnetisch lanthanide ionen (Ln^{3 +}) op van de dubbelgelaagde oppervlak, wat resulteert in een verbeterde magnetische reactie. ¹⁰ voorts, ter vervanging van de in water oplosbare DHPC moleculen met DMPE-DTPA/Ln^{3 +} maakt de vorming van verdunning-resistente bicelles. ¹¹

De magnetische alignability van vlakke polymolecular assembly’s wordt gedicteerd door hun algemeen magnetische energie,

(1)

Indien B de magnetische veldsterkte is, de magnetische constant, n het nummer van de aggregatie en de anisotropie van de moleculaire diamagnetisch gevoeligheid van het samenstellen van de dubbelgelaagde lipiden. Daarom is de reactie van DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles op magnetische velden op maat door hun grootte (totale getal n) en de moleculaire diamagnetisch gevoeligheid anisotropie Δχ. De laatste wordt gemakkelijk bereikt door het veranderen van de aard van de chelaat Ln^{3 +}. ^{12 , 13 , 14 , 15} Introducing cholesterol (Chol-OH) of andere steroïde derivaten in de dubbelgelaagde biedt de mogelijkheid van tuning van zowel de statistische getal n en de Δχ van de magnetische gevoeligheid van de vergaderingen. ^{11 , 16 , 17 , 18 , 19} voor de samenstelling van een bepaald lipide, grotere assemblages bevatten meer lipiden die kunnen bijdragen aan de E-_mag (grotere statistische getal n), wat resulteert in meer alignable soorten. De grootte van DMPC/DHPC bicelles, bijvoorbeeld, wordt conventioneel gecontroleerd door optimalisatie van het componeren vetgehalte voor verhouding of totaal. ^{20 , 21 , 22} maar dit mogelijk in DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles is, hun thermo-omkeerbare transformatie van bicelle naar blaasjes op verwarming aanbiedingen toegevoegd spastische opties. Mechanische betekent zoals extrusie via membraanfilters kunt vormgeven van de blaasjes. Het magnetisch alignable bicelles op koeling tot 5 ° C worden geregenereerd en hun afmetingen van het vesikel precursors worden gedicteerd. ¹¹ Herein, richten we ons op het potentieel van mechanische fabricage procedures met DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molaire verhouding 4:1:1) of DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molaire verhouding 16:4:5:5) als referentiesystemen. Het proces werkt naar analogie bij het werken met andere Ln^{3 +} dan Tm^{3 +}. Het brede scala van mogelijkheden die worden geboden door deze technieken zijn gemarkeerd in Figuur 1 en elders uitvoerig besproken. ²³

Figuur 1: Schematisch overzicht van de mogelijke fabricage procedures. De bestudeerde magnetisch alignable Ln^{3 +} chelaatvormers polymolecular assembly’s zijn samengesteld uit beide DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molaire verhouding 4:1:1) of DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molaire verhouding 16:4:5:5). De droge lipide-film is met een 50 mM fosfaatbuffer op een pH van 7,4 gehydrateerd en het totale vetgehalte is 15 mM. Een effectieve hydratatie van de lipide-film vereist bevriezen of ontdooien cycli (FT) of verwarming en koeling cycli (H & C). H & C cycli zijn nodig om te regenereren monsters na de laatste vorst ontdooien stap, of te regenereren monsters bevroren gehouden over een langere periode van tijd als ze moeten worden gebruikt zonder verdere extrusie. Deze stappen worden uitvoerig besproken door Isabettini et al. ²³ maximaal alignable polymolecular assemblages resultaat wordt bereikt, het leveren van de vergadering van de verschillende platforms gebaseerd op de samenstelling van lipide. De grootte van de bicelle en de magnetische alignability is afstembare door extrusie (Ext) via nanopore membraanfilters. De gepresenteerde uitlijning factoren A_f werden berekend op basis van 2D kleine hoek neutronen verstrooiing (SANS) patronen van een DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (molaire verhouding 16:4:5:5) monster geëxtrudeerd via 800, 400, 200 of 100 nm poriën. SANS metingen zijn een complementaire middelen van het kwantificeren van de uitlijning van de bicelle die niet aan bod komt in meer detail hierin. ^{11 , 16} de A_f varieert van -1 (parallelle neutronen verstrooiing of loodrecht uitlijning van de bicelles met betrekking tot de richting van het magnetisch veld) op 0 voor isotrope verstrooiing.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

De structuur van bicelles is uitgebreid bestudeerd door een breed scala van karakterisering technieken. ¹³ de uitlijning van de bicelles blootgesteld aan een magnetisch veld heeft gekwantificeerd met behulp van NMR-spectroscopie of kleine hoek neutronen verstrooiing (SANS) experimenten. ^{5 , 10 , 11 , 12 , 13 , 16 , 17 , 18 , 19 , 24 , 25} de verschuiving en de verbreding van de pieken van de NMR voordoet in aanwezigheid van Ln^{3 +} zijn echter ernstige beperkingen aan de methode. ^{15 , 26 , 27 , 28} hoewel SANS experimenten lijden niet onder deze beperking, alternatieve en toegankelijker technieken zijn wenselijk voor routinematige kwantificering van magnetisch geïnduceerde uitlijning van assemblages in oplossing. Dubbele breking metingen zijn een levensvatbare en relatief eenvoudig alternatief. Analoog aan NMR experimenten onthullen dubbele breking metingen waardevolle informatie over lipide herschikkingen en lipide fasen die zich voordoen in de dubbelgelaagde. Bovendien, meetkundige transformaties die zich voordoen in de vergadering van de polymolecular met veranderlijke omgevingsomstandigheden zoals temperatuur worden gecontroleerd. ^{11 , 12 , 13 , 16} magnetisch geïnduceerde dubbele breking Δn′ is gebruikt voor het bestuderen van verschillende soorten fosfolipide systemen. ^{13 , 29 , 30} dubbele breking metingen gebaseerd op de techniek van de fase modulatie in een magnetisch veld is een haalbare methode om de oriëntatie van bicelles detecteren. ^{12 , 16 , 18 , 29 , 31 , 32} de mogelijkheid onderzoeken van bicelles met dubbele breking in hoge magnetische velden tot 35 T werd ook aangetoond door M. Liebi et al. ¹³

Als gepolariseerd licht een anisotrope materiaal binnenkomt, zal het worden gebroken in een gewone en buitengewone golf. ¹¹ de twee golven hebben verschillende snelheden en in fase door een δ retardatie worden verschoven. De mate van vertraging δ wordt gemeten en omgezet in een dubbele breking signaal te kwantificeren van de mate van anisotropie in het materiaal met

(2)

waar is λ de golflengte van de laser en d de dikte van het monster. Fosfolipiden zijn optisch anisotrope en hun optische as samenvalt met hun lange moleculaire assen, parallel aan de staarten van koolwaterstof. ^{11 , 12} geen vertraging wordt gemeten als de fosfolipiden willekeurig in oplossing georiënteerde zijn. Vertraging wordt gemeten als fosfolipiden, parallel met elkaar worden uitgelijnd. Het magnetisch geïnduceerde dubbele breking kan hebben een positief of negatief teken afhankelijk van de oriëntatie van de moleculen in het magnetisch veld; Zie Figuur 2. Fosfolipiden parallel uitgelijnd met de x-as zal resulteren in een negatieve , terwijl die uitgelijnd langs de z-as in een positieve resulteren . Geen dubbele breking is waargenomen wanneer de optische as samenvalt met de richting van licht propagatie zoals de fosfolipide uitgelijnd evenwijdig aan de y-as.

Figuur 2: Aanpassing van de fosfolipiden en het bijbehorende teken van het magnetisch geïnduceerde dubbele breking . Het teken van de gemeten is afhankelijk van de oriëntatie van de fosfolipide in het magnetisch veld. Onderbroken lijnen geven de optische as van het molecuul. Het licht is gepolariseerd op 45° en zich voortplant in de y-richting. Het magnetisch veld B is in de z-richting. Dit cijfer is gewijzigd van M. Liebi. ¹¹ Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

In het geval van een isotroop colloïdale suspensie van bicelles zullen de oriëntatie geïnduceerd door de rangschikking van de fosfolipiden in de dubbelgelaagde verloren gaan, de retardatie δ zeroing. De bicelles moet ook uitlijnen om te oriënteren de optisch actieve fosfolipiden in hun bilayers, waardoor een retardatie δ van de gepolariseerd licht. Dubbele breking is derhalve een gevoelig instrument te kwantificeren van de magnetische alignability van de polymolecular-assembly’s. Bicelles uitgelijnd loodrecht op het magnetisch veld resulteert in een positieve , terwijl die parallel uitgelijnd in een negatieve resulteert . Het bord hangt af van de uitlijning van de setup en kan worden gecontroleerd met een referentiemonster.

Protocol

1. fabricage procedure voor DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) en DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 16:4:5:5) polymolecular samenstellen Voorlopige preparaten Wassen alle het glaswerk door te spoelen eenmaal met ethanol gestabiliseerd chloroform (> 99% chloroform) en droog met perslucht. Produceren van 2 verschillende 10 mg/mL voorraadoplossingen van DMPC en DMPE-DTPA in ethanol-gestabiliseerde chloroform (> 99% chloroform), een 10…

Representative Results

Het signaal van de dubbele breking van een niet-geëxtrudeerde DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (molaire verhouding 4:1:1) monster werd gecontroleerd in het kader een 5.5 T magnetisch veld tijdens een verwarming en koeling van de cyclus van 5 tot 40 ° C en terug met een snelheid van 1 ° C/min (Figuur 6). De dubbele breking resultaten bevestigd hoge magnetische uitlijning bij 5 ° C met een waarde van 1,5 x 10-5, twee keer zo sterk wat betreft de g…

Discussion

Een gedetailleerd overzicht van hoe de dubbele breking metingen werden gebruikt in combinatie met SANS experimenten voor de evaluatie van methoden voor het genereren van zeer magnetisch responsieve Ln^{3 +} chelaat fosfolipiden assemblages is in Isabettini et al. ²³ de voorgestelde fabricage-protocollen zijn ook van toepassing voor assembly’s die zijn samengesteld uit de langere DPPC en DPPE-DTPA fosfolipiden of voor degenen met chemisch gemodificeerde steroïde derivaten in hun d…

Materials

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439649	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Dysprosium(III) chloride	Sigma-Aldrich	325546	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Ytterbium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439614	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Chloroform	Sigma-Aldrich	319988	contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	≥99.9%
Cholesterol	Amresco	433	Ultra pure grade
D2O	ARMAR chemicals	1410	99.8 atom % D
Ultrapure water	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
electronic pH meter	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter	VWR	515-2032
Whatmann Filter paper	VWR	230600
25 ml round bottom flask	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml glass snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2.5 ml glass syringe	Hamilton
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merk	1.06342	Salt used to make phosphate buffer
di-Sodium hydrogen phosphate	Merk	1.06586	Salt used to make phosphate buffer
Liquid Nitrogen	Carbagas	–
Pressurized Nitrogen gas	Carbagas	–	200 bar bottle
Lipid Extruder 10 ml	Lipex	–	Fully equipped with thermobarrel
High-pressure PVC tube	GR NETUM	–	must resist more than 4 MPa
Serto adaptors	Sertot	–
Nitrile gloves	VWR	–
2 ml glass pipettes	VWR	612-1702	230 mm long
Diode Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Photodiode Detector	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicon, photo-conductive
5.5 T Cryogenic Magnetic	Cryogenic/Oerlikon AG	–	12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
Second order low pass filter	home-built	–	Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Photoelastic modulator	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polarizer	Newport	10GT04	25.4mm diameter
Quartz sample cuvette	Hellma	165-10-40	temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
Temperature probe	Thermocontrol	–	Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
Non-polarizing mirrors	Newport	50326-1002	25.4mm
RS 232 cables	National Instruments	189284-02	For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
BNC 50 Ω cable and connectors	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National Instruments	–
Industrial power supply	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Waterbath	Julabo	FP40-HE	refrigerated/Heating Circulator