Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies

St&#233;phane Isabettini; Mirjam E. Baumgartner; Peter Fischer; Erich J. Windhab; Marianne Liebi; Simon Kuster

doi:10.3791/56812

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Engenharia

Procedure di fabbricazione e birifrangenza misurazioni per la progettazione di ioni lantanidi magneticamente reattivo chelanti del fosfolipide assembly

Published: January 03, 2018

doi:

10.3791/56812

Stéphane Isabettini, Mirjam E. Baumgartner, Peter Fischer, Erich J. Windhab, Marianne Liebi, Simon Kuster

¹Laboratory of Food Process Engineering,ETH Zurich, ²MAX IV Laboratory,Lund University

Summary

Procedure di fabbricazione per lo ione altamente magneticamente reattivo dei lantanidi chelanti polimolecolari assembly sono presentate. La risposta magnetica è dettata dalle dimensioni di montaggio, che sono su misura per estrusione attraverso membrane nanopore. Alignability magnetica indotta da temperatura cambiamenti strutturali e le assemblee sono monitorati da misurazioni di birifrangenza, una tecnica gratuita per risonanza magnetica nucleare e lo scattering di neutroni piccolo angolo.

Abstract

Bicelles sono assembly sintonizzabile discoidale polimolecolari formato da una grande varietà di miscele del lipido. Le applicazioni spaziano da studi strutturali di proteine di membrana di risonanza magnetica nucleare (NMR) agli sviluppi nanotecnologici, compresa la formazione di gel otticamente attivi e magneticamente commutabile. Tali tecnologie richiedono elevato controllo delle dimensioni di montaggio, risposta magnetica e resistenza termica. Miscele di 1,2-dimiristoil –sn– glicero-3-fosfocolina (DMPC) e suoi ioni lantanidi (Ln^{3 +}) chelanti coniugato del fosfolipide, 1,2-dimiristoil –sn– glicero-3-fosfo-etanolamina-dietilenico triaminepentaacetate ( DMPE-DTPA), assemblare in assembly altamente magneticamente reattivo ad esempio DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) bicelles. Introduzione di colesterolo (Chol-OH) e steroidi derivati in doppio strato si traduce in un altro insieme di assembly che offre proprietà fisico-chimiche uniche. Per una composizione lipidica dato, il alignability magnetico è proporzionale alla dimensione di bicelle. La complessazione di Ln^{3 +} si traduce in risposte magnetiche senza precedenti in termini di direzione sia di grandezza e di allineamento. Il crollo di termo-reversibile del disco-come le strutture in vescicole su riscaldamento permette di sartoria di dimensioni degli assiemi per estrusione attraverso filtri a membrana con pori definiti. Il bicelles magneticamente allineabile vengono rigenerate mediante raffreddamento a 5 ° C, con conseguente montaggio dimensioni definite da precursori della vescicola. Qui, questa procedura di montaggio è spiegata e la alignability magnetica delle assemblee è quantificata mediante misure di birifrangenza sotto un 5,5 campo magnetico T. Il segnale di birifrangenza, proveniente dal bilayer del fosfolipide, ulteriormente consente il monitoraggio di polimolecolari cambiamenti che si verificano in doppio strato. Questa semplice tecnica è complementare agli esperimenti NMR che sono comunemente impiegati per caratterizzare bicelles.

Introduction

Bicelles sono assembly polimolecolari discoidale ottenuti dalle numerose miscele di lipidi. ¹ ^, ² ^, ³ ^, ⁴ ^, ⁵ essi sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione strutturale di biomolecole di membrana tramite spettroscopia NMR. ⁶ ^, ⁷ tuttavia, i recenti sforzi mirano a espandere il campo delle possibili applicazioni. ⁵ ^, ⁸ ^, ⁹ il sistema di bicelle più studiato è composto da una miscela di 1,2-dimiristoil –sn– glicero-3-fosfocolina (DMPC), che costituiscono la parte piana dell’Assemblea e 1,2-dihexanoyl –sn– glicero-3-fosfocolina (DHPC) fosfolipide che copre il bordo. ¹ ^, ² ^, ³ la geometria molecolare dei fosfolipidi che compongono il bilayer dettare l’architettura della struttura polimolecolari auto-assemblati. ⁴ ^, ⁵ sostituzione DHPC con DMPE-DTPA genera sistemi altamente magneticamente reattivo e sintonizzabile bicelle. ¹⁰ ^, ¹¹ DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) bicelles associare con molti più ioni paramagnetici lantanidi (Ln^{3 +}) sulla superficie di doppio strato, conseguente a una risposta magnetica migliorata. ¹⁰ inoltre, sostituendo le molecole solubili in acqua di DHPC con^{3 +} consente di DMPE-DTPA/Ln la formazione di diluizione-resistente bicelles. ¹¹

La alignability magnetica di planare polimolecolari assembly è dettata dalla loro energia nel complesso magnetico,

(1)

dove B è l’intensità del campo magnetico, il magnetico costante, n il numero di aggregazione e l’anisotropia diamagnetica molecolare suscettibilità dei lipidi che compongono il bilayer. Di conseguenza, la risposta di DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles ai campi magnetici è su misura dal loro formato (aggregazione numero n) e il Δχ di anisotropia diamagnetica molecolare di suscettibilità. Quest’ultima è realizzata prontamente modificando la natura del chelato Ln^{3 +}. ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ Introduzione colesterolo (Chol-OH) o altri derivati steroidi in doppio strato offre la possibilità di tuning sia il numero n di aggregato e la Δχ di suscettività magnetica degli assembly. ¹¹ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ per una composizione lipidica determinato, grandi assemblee contengono più lipidi capaci di contribuire alla E_mag (più grande aggregazione numero n), con conseguente più regolabile in specie. La dimensione del DMPC/DHPC bicelles, ad esempio, convenzionalmente è controllata tramite l’ottimizzazione la composizione lipidica rapporto totale della concentrazione di o. ²⁰ ^, ²¹ ^, ²² anche se questo è possibile in DMPC/DMPE-DTPA/Ln^{3 +} bicelles, loro trasformazione termo-reversibile da bicelle a vescicole su riscaldamento offerte aggiunto opzioni di sartoriale. Meccanica significa come estrusione attraverso filtri a membrana permette di modellare delle vescicole. Il bicelles magneticamente allineabile vengono rigenerate sul raffreddamento a 5 ° C e le loro dimensioni sono dettate da precursori della vescicola. ¹¹ qui, ci concentriamo sul potenziale delle procedure di fabbricazione meccanica con DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) come sistemi di riferimento. Il processo funziona Analogamente quando si lavora con altri Ln^{3 +} Tm^{3 +}. L’ampia gamma di possibilità offerte da queste tecniche sono evidenziati in Figura 1 e ampiamente discussa altrove. ²³

Figura 1: Panoramica schematica delle procedure di fabbricazione possibile. Studiato magneticamente allineabile Ln^{3 +} chelante polimolecolari assembly sono composti da entrambi DMPC/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 4:1:1) o DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5). Il film lipidico asciutto è idratato con un tampone fosfato 50 mM ad un valore di pH di 7,4 e la concentrazione dei lipidi totale è di 15 mM. Un’efficace idratazione del film lipidico richiede sia congelare scongelamento cicli (FT) o riscaldamento e raffreddamento cicli (H & C). H & C cicli sono necessari per rigenerare i campioni dopo il gelo ultimo passaggio di scioglimento o per rigenerare i campioni tenuti congelati per un periodo prolungato di tempo, se devono essere usati senza ulteriore estrusione. Questi passaggi sono ampiamente discussa da Isabettini et al. ²³ al massimo allineabile polimolecolari assembly vengono raggiunti, offrendo architetture di assembly diverso sulla base della composizione lipidica. La dimensione di bicelle e la alignability magnetica è sintonizzabile per estrusione (Ext) attraverso filtri a membrana nanopore. L’allineamento presentato fattori A_f sono stati computati da modelli di dispersione (SANS) 2D angolo piccolo neutrone di un DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm^{3 +} (rapporto molare 16:4:5:5) campione estruso attraverso 800, 400, 200 o 100 nm pori. SANS misurazioni sono un mezzo complementare di quantificare l’allineamento di bicelle che non verrà trattato in dettaglio nel presente documento. ¹¹ ^, ¹⁶ l’A_f varia tra -1 (scattering di neutroni parallela o perpendicolare allineamento di bicelles rispetto alla direzione del campo magnetico) e 0 per scattering isotropo.Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La struttura del bicelles è stata studiata estesamente da una vasta gamma di tecniche di caratterizzazione. ¹³ l’allineamento del bicelles esposti ad un campo magnetico è stato quantificato mediante spettroscopia NMR o esperimenti di scattering (SANS) angolo piccolo neutrone. ⁵ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ ^, ¹⁸ ^, ¹⁹ ^, ²⁴ ^, ²⁵ tuttavia, lo spostamento e l’ampliamento dei picchi NMR che si verificano in presenza di Ln^{3 +} sono gravi limitazioni al metodo. ¹⁵ ^, ²⁶ ^, ²⁷ ^, ²⁸ sebbene SANS esperimenti non soffrono di questa limitazione, alternativa e tecniche più accessibili sono desiderabili per quantificazione sistematica di allineamento magneticamente indotta degli assembly nella soluzione. Birifrangenza misurazioni sono un’alternativa praticabile e relativamente semplice. Analogamente agli esperimenti NMR, birifrangenza misure rivelano preziose informazioni su riorganizzazioni del lipido e fasi del lipido che si verificano in doppio strato. Inoltre, vengono monitorate trasformazioni geometriche che si verificano nell’assembly polimolecolari con mutevoli condizioni ambientali come la temperatura. ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁶ Δn′ birifrangenza magneticamente indotta è stato utilizzato per studiare vari tipi di sistemi del fosfolipide. ¹³ ^, ²⁹ ^, ³⁰ misure di birifrangenza basate sulla tecnica della modulazione di fase in un campo magnetico è un metodo praticabile per rilevare l’orientamento del bicelles. ¹² ^, ¹⁶ ^, ¹⁸ ^, ²⁹ ^, ³¹ ^, ³² la possibilità di studiare bicelles con Birifrangenza in alti campi magnetici fino a 35 T inoltre è stata dimostrata da Liebi M. et al. ¹³

Quando la luce polarizzata entra un materiale anisotropo, esso sarà rifratti in un’ondata di ordinaria e straordinaria. ¹¹ le due onde hanno velocità differenti e sono spostate in fase di un δ di ritardo. Il grado di ritardo δ è misurato e convertito in un segnale di birifrangenza per quantificare il grado di anisotropia nel utilizzando materiale

(2)

dove λ è la lunghezza d’onda del laser e d è lo spessore del campione. I fosfolipidi sono otticamente anisotropici e loro asse ottico coincide con le loro ascie lungo molecolare, parallele alle code dell’idrocarburo. ¹¹ ^, ¹² nessun ritardo è misurato se i fosfolipidi sono orientati in modo casuale in soluzione. Il ritardo è misurato quando i fosfolipidi sono allineati parallelamente a vicenda. La birifrangenza magneticamente indotta può avere un segno positivo o negativo a seconda dell’orientamento delle molecole nel campo magnetico; vedere la Figura 2. Fosfolipidi allineati parallelamente all’asse x si tradurrà in un negativo , mentre quelli allineati lungo l’asse z, che provocare un positivo . Nessun birifrangenza è osservata quando l’asse ottico coincide con la direzione di propagazione della luce come il fosfolipide allinea parallelo all’asse y.

Figura 2: Allineamento dei fosfolipidi e corrispondente segno della birifrangenza magneticamente indotta . Il segno di quella misurata dipende dall’orientamento del fosfolipide nel campo magnetico. Le linee tratteggiate indicano l’asse ottico della molecola. La luce è polarizzata a 45° e si propaga in direzione y. Il campo magnetico B è nella direzione z. Questa figura è stata modificata da M. Liebi. ¹¹ Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nel caso di una sospensione colloidale isotropica di bicelles, l’orientamento indotta tramite la disposizione dei fosfolipidi in doppio strato andranno perso, azzerando il δ di ritardo. Il bicelles inoltre deve allineare al fine di orientare i fosfolipidi otticamente attivi in loro strati lipidici, causando un ritardo δ della luce polarizzata. Di conseguenza, la birifrangenza è uno strumento sensibile per quantificare la alignability magnetica di polimolecolari assembly. Bicelles allineato perpendicolarmente al campo magnetico produrrà un positivo , mentre quelli allineati parallelamente produrrà un negativo . Il segno dipende l’allineamento dell’installazione e può essere controllato con un campione di riferimento.

Protocol

1. procedura di fabbricazione DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) e DMPC/Chol-OH/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 16:4:5:5) polimolecolari assembly Preparazioni preliminari Lavare tutta la vetreria di vampate di calore una volta con etanolo stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio) e asciugare con aria compressa. Produrre 2 soluzioni di riserva distinti 10 mg/mL di DMPC e DMPE-DTPA in etanolo-stabilizzato cloroformio (> 99% cloroformio), una soluz…

Representative Results

Il segnale di birifrangenza di una non-estruso DMPC/DMPE-DTPA/Tm3 + (rapporto molare 4:1:1) campione è stato monitorato sotto un 5,5 campo magnetico T durante un riscaldamento e raffreddamento da 5 a 40 ° C e ritorno a un tasso di 1 ° C/min (Figura 6). I risultati di birifrangenza confermano alti allineamenti magnetici a 5 ° C con un valore di 1.5 x 10-5, due volte più forte per quanto riguarda i sistemi di estrusi segnalati. <sup c…

Discussion

Un resoconto dettagliato di come birifrangenza misure sono state usate in combinazione con SANS esperimenti per valutare i metodi per la generazione altamente magneticamente reattivo Ln^{3 +}chelanti fosfolipidi assembly è in Isabettini et al. ²³ i protocolli di fabbricazione proposto sono anche applicabili per gli assembly composti dei fosfolipidi DPPC e DPPE-DTPA più lunghi o per quelli contenenti derivati steroidi chimicamente derivati dal loro doppio strato. <sup class="xre…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori riconoscono la Swiss National Science Foundation per finanziamento SMhardBi (progetto numero 200021_150088/1). I SANS esperimenti sono stati eseguiti presso la sorgente di neutroni di spallazione svizzero SINQ, Paul Scherrer Instute, Villigen, Svizzera. Gli autori ringraziano calorosamente il Dr. Joachim Kohlbrecher per la sua guida con gli esperimenti SANS. Il setup di misura birifrangenza sotto alti campi magnetici è stato ispirato dal programma di installazione esistente presso il laboratorio di magnetico ad alto campo HFML, Nijmegen, Paesi Bassi. Ringraziamo Bruno Pfister per il suo aiuto nello sviluppo dell’elettronica del setup birifrangenza, Jan Corsano e Daniel Kiechl per la costruzione dei quadri permettendo bene e facile allineamento del laser e Dr. Bernhard Koller per supporto tecnico continuo.

Materials

1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC)	Avanti Polar Lipids	850345P	>99%
1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phospho-ethanolamine-diethylene triaminepentaacetate acid hexammonium salt (DMPE-DTPA)	Avanti Polar Lipids	790535P	>99%
Thulium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439649	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Dysprosium(III) chloride	Sigma-Aldrich	325546	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Ytterbium(III) chloride	Sigma-Aldrich	439614	anhydrous, powder, 99.9% trace metals basis
Chloroform	Sigma-Aldrich	319988	contains ethanol as stabilizer, ACS reagent, ≥99.8%
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	≥99.9%
Cholesterol	Amresco	433	Ultra pure grade
D2O	ARMAR chemicals	1410	99.8 atom % D
Ultrapure water	Millipore		Synergy pak2 (SYPK0SIX2), Millipack GP (MPGP02001)
electronic pH meter	Metrohm	17440010
Whatmann Nuclepore 25 mm 100nm membrane filter	VWR	515-2028
Whatmann Nuclepore 25 mm 200nm membrane filter	VWR	515-2029
Whatmann Nuclepore 25 mm 400nm membrane filter	VWR	515-2030
Whatmann Nuclepore 25 mm 800nm membrane filter	VWR	515-2032
Whatmann Filter paper	VWR	230600
25 ml round bottom flask	VWR	201-1352	14/23 NS
3 ml glass snap-cup	VWR	548-0554	ND18, 18x30mm
2.5 ml glass syringe	Hamilton
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merk	1.06342	Salt used to make phosphate buffer
di-Sodium hydrogen phosphate	Merk	1.06586	Salt used to make phosphate buffer
Liquid Nitrogen	Carbagas	–
Pressurized Nitrogen gas	Carbagas	–	200 bar bottle
Lipid Extruder 10 ml	Lipex	–	Fully equipped with thermobarrel
High-pressure PVC tube	GR NETUM	–	must resist more than 4 MPa
Serto adaptors	Sertot	–
Nitrile gloves	VWR	–
2 ml glass pipettes	VWR	612-1702	230 mm long
Diode Laser	Newport	LPM635-25C
DSP Dual Phase Lock-in Amplifier	SRS	SR830
Photodiode Detector	Silonex Inc.	SLSD-71N5	5mm2, Silicon, photo-conductive
5.5 T Cryogenic Magnetic	Cryogenic/Oerlikon AG	–	12 bar He-cooled. RW4000/6000 compressor, RGD 5/100 TA cryo-head
Second order low pass filter	home-built	–	Linear power supply 24V DC, second order, Sallen Key, cut-off frequency 360 Hz, +/- 12V, max 10 mA
Photoelastic modulator	Hinds instruments	PEM-90
Glan-Thompson Calcite Polarizer	Newport	10GT04	25.4mm diameter
Quartz sample cuvette	Hellma	165-10-40	temperature controlled cell, 0.8 ml, 10mm path length
Temperature probe	Thermocontrol	–	Type K, 0.5mm diameter, Thermocoax
Non-polarizing mirrors	Newport	50326-1002	25.4mm
RS 232 cables	National Instruments	189284-02	For Connecting to the RS-232 Port on the front of Compact FieldPoint Controllers
BNC 50 Ω cable and connectors	National Instruments	763389-01
cFP-AI-110	National Instruments	777318-110	8-Channel Analog Voltage and Current Input Module for Compact FieldPoint
cFP-CB-1	National Instruments	778618-01	Integrated Connector Block for Wiring to Compact FieldPoint I/O
cFP-CB-3	National Instruments	778618-03	Integrated Isothermal Connector Block for Wiring Thermocouples to the cFP-TC-120 Module
cFP-TC-120	National Instruments	777318-120	8-Channel Thermocouple Input Module for Compact FieldPoint
cFP-1804	National Instruments	779490-01	Ethernet/Serial Interface for NI Compact FieldPoint
LabView 2010	National Instruments	–
Industrial power supply	Traco Power	TCL 060-124	100-240V AC
Waterbath	Julabo	FP40-HE	refrigerated/Heating Circulator

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Isabettini, S., Baumgartner, M. E., Fischer, P., Windhab, E. J., Liebi, M., Kuster, S. Fabrication Procedures and Birefringence Measurements for Designing Magnetically Responsive Lanthanide Ion Chelating Phospholipid Assemblies. J. Vis. Exp. (131), e56812, doi:10.3791/56812 (2018).