DNA-magnetiske partikler bindende analyse av dynamisk og Electrophoretic lysspredning

Summary

Denne protokollen beskriver syntesen av magnetiske partikler og evaluering av deres DNA-bindingsegenskapene via dynamisk og electrophoretic lysspredning. Denne metoden fokuserer på å overvåke endringer i partikkelstørrelse, deres polydispersity og zeta potensialet av partikkel overflate som spiller stor rolle i binding av materialer som DNA.

Abstract

Isolering av DNA ved å bruke magnetiske partikler er et felt av høy betydning i bioteknologi og molekylærbiologi. Denne protokollen beskriver evalueringen av DNA-magnetiske partikler bindende via dynamisk lysspredning (DLS) og electrophoretic lysspredning (ELS). Analyse av DLS gir verdifull informasjon i partikler inkludert partikkelstørrelse, polydispersity og zeta potensielle mekanisk-egenskaper. Sistnevnte beskriver overflaten tillegget av partikkel som spiller stor rolle i elektrostatisk binding av materialer som DNA. Her, utnytter en komparativ analyse tre kjemiske modifikasjoner av nanopartikler og microparticles og deres effekter på DNA bindende og elueringsrør. Kjemiske modifikasjoner av forgrenede polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate og (3-aminopropyl) triethoxysilane er undersøkt. Siden DNA utstillinger en negativ ladning, forventes det at zeta potensialet i partikkel overflaten vil avta ved binding av DNA. Forming av klynger bør også påvirke partikkelstørrelse. For å undersøke effektiviteten av disse partiklene i isolasjon og elueringsrør DNA, er partiklene blandet med DNA i lav pH (~ 6), høy ioniske styrke og dehydrering miljø. Partiklene er vasket på magnet og deretter DNA er elut av Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA kopi nummer er beregnet ved hjelp av kvantitative polymerasekjedereaksjons (PCR). Zeta potensial, partikkelstørrelse, polydispersity og kvantitative PCR data evalueres og forhold. Distribusjonslister er en innsiktsfull og støtte metoden analyse som gir et nytt perspektiv til prosessen med screening av partikler DNA isolering.

Introduction

DNA isolasjon er en av de viktigste trinnene i molekylærbiologi. Utviklingen av nukleinsyre utvinning metoder har stor innvirkning på nye felt av genomics, metagenomics, epigenetics og transcriptomics. Det er en rekke bioteknologisk programmer DNA isolering inkludert medisinsk (rettsmedisinske/diagnoseverktøy og prognostiske biomarkers) og miljømessige programmer (metagenomic biologisk mangfold, patogen utbredelse og overvåking). Det har vært økende etterspørselen å rense og isolere DNA av forskjellige materialer og i ulike skalaer som blod, urin, jord, tre og andre typer prøver. ^{1 , 2 , 3 , 4}

Nano – og mikrostørrelse partikler er egnet for DNA isolasjon på grunn av deres høye areal og spesielt når de kan bli immobilisert av et magnetfelt. Mekanisk-egenskaper av partikler, for eksempel størrelse eller kostnad, kan sterkt påvirke deres evne til å binde målet biomolecules. ⁵ forbedre binding av biomolecules og stabilisere partikler, ulike kjemiske modifikasjoner (overflatebelegg) utnyttes. De mange forskjellige strategiene for bindingen klassifiseres etter kovalente og ikke-kovalente interaksjoner. ⁶ størrelsen på partikler direkte påvirker magnetization egenskaper, mens partikkel komposisjon kan skreddersys etter innlemmelse av metallisk, legering eller annet materiale som kan påvirke sin tetthet, porøsitet og overflaten. ⁷ det er ingen pålitelig måte å måle overflate ansvaret for små partikler. I stedet kan elektrisk potensial på forsinkede flyet (stykke fra hydrogenion overflaten) måles. ⁸ denne verdien kalles zeta potensielle og det er et potent verktøy som vanligvis brukes for evalueringen nano- og microparticle stabilitet via DLS. ⁹ siden verdien er svært avhengig ikke bare av pH og ioniske styrke dispersiv miljøet, men også på overflaten karakteristikkene av partikler, kan det også være endringer i denne overflaten forårsaket av samspillet mellom de partikler og molekyl av interesse. ¹⁰

På den annen side, forekommende DNA struktur i dehydrert forhold (A-DNA skjema) utstillinger komprimerte konformasjonen som letter sin nedbør (samling) i forhold til vanlig B-DNA-skjemaet. Elektrostatisk (joniske og H-bånd) er de store styrkene kontrollere bindingen DNA til andre materialer på grunn av deres sterically tilgjengelig fosfat og nitrogen baser (spesielt guanine). ^{7 , 10}

I dette arbeidet, analyseres tre representant kjemiske endringer av magnetiske nanopartikler og microparticles (figur 1A). Metoden for syntese og kjemisk endring av nanopartikler og microparticles er beskrevet. En forpliktende løsning, at avtalen teoretisk prinsipper for DNA nedbør (pH, ionisk styrke og dehydrering), brukes til å evaluere DNA bindende og elueringsrør. Kvantitativ PCR brukes til å evaluere elueringsrør effektiviteten av DNA fra representant nanopartikler og microparticles (figur 1B). Partikkelstørrelse, polydispersity indeks og zeta potensielle er viktige parametere som brukes til å visualisere mekanisk-endringene som skjer på partikkel overflate (figur 1 c). Det er viktig å understreke på kjemisk karakterisering av magnetiske partikler overflaten. Mens dette er utenfor omfanget av denne protokollen, brukes flere moderne teknikker for å undersøke effektiviteten av kjemiske modifikasjoner. ^{11 , 12 , 13 , 14} Fourier transformere infrarød spektroskopi (FTIR) kan brukes til å vurdere infrarød spekteret av partikkel overflaten og sammenlign det med spekteret av gratis kjemiske modifikatorer. X-ray photoelectron spektroskopi (XPS) er en annen teknikk som kan brukes til å identifisere elementær sammensetningen av materialoverflaten. Andre elektrokjemiske, mikroskopiske og spektroskopiske metoder kan brukes til å belyse kvaliteten på partikkel syntese. Dette arbeidet fremhever et nytt perspektiv til å analysere DNA-magnetiske partikler interaksjoner via DLS.

Protocol

1. magnetiske nanopartikler syntese syntese av magnetiske nanopartikler stabilisert med citrate (MNPs) legge til 20 mmol FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5.406 g) og 10 mmol av FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1.988 g) i 20 mL deoxygenated dobbel destillert vann (ddd vann). Rør innhentet løsning kraftig i beaker under N 2 atmosfære med en mekanisk rørestang til en gjennomsiktig løsning oppnås. Under rask mekanisk omrøring, Legg 150…

Representative Results

Bruker protokollen beskrevet her for syntese og modifikasjon av magnetiske partikler, ble seks magnetiske partikler syntetisert og analysert for DNA bindingen. Et sammendrag av analysen er vist i tabell 1. Ved å sammenligne partikkelstørrelse i vann og i forpliktende løsning, er det klart at alle partikler samlet i bindende løsning av 2-22 folder. Noen partikler videre samlet til flere kaster i nærvær av DNA; men dette var ikke direkte korrelert med DNA henting oppd…

Discussion

I denne protokollen var teoretisk prinsippene som forklarer DNA binding til magnetiske partikler via zeta potensielle under spørsmål. Protokollen beskriver syntese og modifikasjon av magnetiske nanopartikler og microparticles. Metode for utarbeidelse av DNA kontroll og forpliktende løsning er også beskrevet. To strategier vises her for screening av DNA-partikkel interaksjoner: kvantitative PCR og DLS tilnærminger. DLS gir tre indikatorer mekanisk-endringer i partikler: partikkelstørrelse, polydispersity indeks og z…

Materials

Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	207926	Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	380024	Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8263	Magnetic particle synthesis
Acetone	Penta	10060-11000	Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	W302600	Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate	Sigma-Aldrich	131903	Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma-Aldrich	408727	Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228-M	Magnetic particle synthesis
Ethanol	Penta	71250-11000	Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate	Sigma-Aldrich	P6083	Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.05012	Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)	Spectrum labs	G235063	Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer	witeg Labortechnik GmbH	DH.WOS01035	Magnetic particle synthesis
Waterbath	Memmert GmbH + Co.	84198998	Magnetic particle synthesis
Sonicator	Bandelin	795	Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759200-100EA	Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759240-100EA	Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell	Malvern	DTS1070	Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO NanoQuant instrument	Tecan	396 227 V1.0, 04-2010	device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit	Sigma-Aldrich	QR0100	PCR kit
Mastercycler pro S instrument	Eppendorf	6325 000.013	Thermocycler
MinElute kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S7670	DNA binding