Genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering
Summary
Translationell förordning spelar en viktig roll i kontrollen av protein överflöd. Här beskriver vi en hög genomströmning metod för kvantitativ analys av översättning i spirande jästen Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Översättning av mRNA till proteiner är en komplex process som involverar flera lager av förordning. Det antas ofta att förändringar i mRNA transkription återspegla förändringar i proteinsyntesen, men många undantag har observerats. Nyligen, en teknik som kallas ribosomer profilering (eller Ribo-Seq) har vuxit fram som en kraftfull metod som möjliggör identifiering, med hög noggrannhet, vilka regioner av mRNA översätts till proteiner och kvantifiering av översättning på genome-wide nivå. Här presenterar vi en generaliserad protokoll för genome-wide kvantifiering av översättning med Ribo-Seq i spirande jäst. Dessutom tillåter kombinera Ribo-Seq data med mRNA överflöd mätningar oss att samtidigt kvantifiera översättning effektivitet av tusentals mRNA avskrifter i samma prov och jämföra förändringar av dessa parametrar som svar på experimentella manipulationer eller i olika fysiologiska tillstånd. Vi beskriver ett detaljerat protokoll för generering av Ribosomen fotspår med nuclease-nedbrytning, isolering av intakt Ribosomen-fotavtryck komplex via sackaros gradient fraktionering och beredning av DNA bibliotek för djupsekvensering tillsammans med lämpliga kvalitetskontroller som är nödvändiga för att säkerställa korrekt analys av in-vivo översättning.
Introduction
mRNA översättning är en av de grundläggande processerna i cellen, som spelar en viktig roll i regleringen av proteinuttryck. Därför kontrolleras tätt mRNA översättning svar till olika interna och externa fysiologiska stimuli 1,2. Mekanismerna för translationell förordning dock understudied. Här beskriver vi protokollet för genome-wide kvantifiering av översättning i spirande jäst av Ribosomen profilering. Det övergripande målet med Ribosomen profilering tekniken är att studera och kvantifiera översättningen av specifika mRNA under olika cellulära förhållanden. Denna teknik använder nästa generations sekvensering att kvantitativt analysera Ribosomen beläggning i hela genomet och tillåter övervakning av proteinsyntes i vivo på enda kodon resolution 3,4. För närvarande, denna metod ger de mest avancerade metoder för att mäta nivåerna av protein översättning, och har visat sig vara en användbar upptäckt verktyg som ger information som inte kan avslöjas genom andra tillgängliga tekniker, e.g. microarrays eller Översättning staten array analys (TSAA) 5. Som Ribosomen profilering rapporter på de sammanslagna förändringarna i avskrift nivåer och translationell utgång, ger det också mycket större känslighet jämfört med andra metoder.
Denna strategi är baserad på djupsekvensering av Ribosomen-skyddade mRNA fragment 3. Under protein översättning, ribosomer skydda ~ 28 nt delar av mRNA (kallas fotspår) 6. Genom att bestämma sekvensen av Ribosomen-skyddade fragment, kan Ribo-Seq kartlägga placeringen av ribosomer på översatta mRNA och identifiera vilka områden i mRNA sannolikt översättas aktivt till protein 3,7. Dessutom kan vi kvantitativt mäta översättningen av mRNA genom att räkna antalet fotspår som anpassas till en viss mRNA-avskrift.
För att isolera de ribosom-skyddade fragment, behandlas cell lysates initialt med en översättning-hämmare till stall ribosomerna följt av ribonunkleas matsmältningen. Medan gratis mRNA och delar av översatta mRNA inte skyddas av ribosomer är förstörd av ribonunkleas, kan ribosom-skyddade mRNA fragment återvinnas genom att rena intakt Ribosomen-fotavtryck komplex. Dessa mRNA fotspår är sedan omvandlas till cDNA bibliotek och analyseras genom djupsekvensering (figur 1). Parallellt till Ribosomen profilering, intakt mRNA extraheras från samma prov och sekvenserade. Genom att jämföra nivån på översättning identifieras av Ribo-Seq med mRNA överflöd mätningar, kan vi identifiera gener som är specifikt upp – eller ner-reglerade i nivå med översättning och beräkna effektivitet i mRNA på genome-wide nivå. Protokollet beskrivs i denna artikel är specifika för jäst, bör det också vara användbar för forskare som försöker upprätta protokollet Ribo-Seq i andra system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden med Ribo-Seq har vuxit fram som en kraftfull teknik för analys av mRNA översättning i vivo på genome-wide nivå 3. Studier med hjälp av denna metod, som tillåter övervakning översättning med singel-kodon upplösning, har bidragit till vår förståelse för translationell förordning. Trots sina fördelar har Ribo-Seq flera begränsningar. Ribosomalt RNA (rRNA) fragment är alltid Co renat under isolering av Ribosomen-skyddade fotspår minskar avkastningen av användbar s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av de National institutionerna of Health bidrag AG040191 och AG054566 att VML. Denna forskning utfördes medan VML var en AFAR forskningsbidrag mottagaren från det amerikanska förbundet för åldrande forskning.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
Referências
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3′ untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O’Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
