הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור
Summary
בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך של דגים זרע הערכה באמצעות ניתוח המחשב בסיוע זרע, התקני קירור. התוכנה נותנת מהירה, מדויקת, ניתוח כמותי של איכות הזרע דגים בהתבסס על spermatozoa מורפולוגית, יכול להיות כלי שימושי חקלאות מים כדי לשפר את ההצלחה רבייה.
Abstract
להערכת איכות תא רבייה, ישנן טכניקות חדשניות, מהירה, כמותיים שיכול לספק נתונים שימושיים עבור חקלאות ימית. מערכות ממוחשבות לניתוח זרע פותחו כדי למדוד פרמטרים מספר, באחד נמדד בדרך כלל תנועתיות הזרע.
בתחילה, טכנולוגיית מחשב זה תוכנן עבור יונקים, למרות שזה יכול לשמש גם לצורך ניתוח זרע של דג. לדגים יש תכונות ספציפיות אשר יכולים להשפיע על זרע הערכה כגון זמן קצר תנועתיות לאחר ההפעלה ו, במקרים מסוימים, הסתגלות כדי להוריד את הטמפרטורה. לכן, זה הכרחי לשנות רכיבי תוכנה וחומרה לבצע ניתוח תנועתיות יעילה יותר לניתוח זרע של דג. לזרע יונקים, הצלחת חימום משמש כדי לשמור על טמפרטורות אופטימלית של spermatozoa. עם זאת, עבור כמה זני דגים, זה יתרון לשימוש בטמפרטורה נמוכה כדי להאריך את משך הזמן של תנועתיות, מאז הזרע להישאר פעיל למשך פחות מ 2 דקות. לכן, התקני הצינון יש צורך לקרר את דגימות בטמפרטורה קבועה על פני הזמן של ניתוח, כולל על המיקרוסקופ האופטי. פרוטוקול זה מתאר הניתוח של תנועתיות הזרע דגים באמצעות תוכנה לניתוח זרע וקירור חדש התקנים כדי למטב את התוצאות.
Introduction
היעילות של רבייה תלויה באיכות של שתי גמטות (ביצים, זרע)1,2. . זה הגורם אשר תורם הפריה מוצלחת, ומאפשר התפתחות הצאצאים קיימא3,4 הערכת איכות תא רבייה נוח הוא הכלי הטוב ביותר עבור הגדרת את פוטנציאל הפוריות של הדגימה.
ערבוב זרע מן הזכרים מרובים הוא מנהג נפוץ בייצור של מינים ימיים מסחריים רבים4. עם זאת, ההשתנות זרע בין הזכרים יכול להוביל זרע תחרות, כתוצאה מכך, לא כל הגברים באותה מידה תורמים מאגר הגנים5. במובן זה, הערכת הנכונות לפלוט בודדים/spermatozoa תכונות, כגון תנועתיות, הוא היסוד המפלה מידע לגבי פוריות הגבר בודדים פוטנציאליים. התבוננות תנועתיות הזרע יכול להפיק נתונים לא מדויקים ולא סובייקטיבי כפי שהוא דורש זמן וניסיון, מה שמוביל חוסר עקביות של אי-תאימות של תוצאות6,7. עם זאת, ישנם טכניקות חדשניות, מהיר ולא כמותית רבות שיכול לספק2,4ניתוח איכות הזרע אמין.
ניתוח המחשב בסיוע זרע פותחה להציע נתונים מדויקים לגבי איכות הזרע8. טכנולוגיה זו כוללת הפיתוח של תוכנה הקשורים עם מיקרוסקופ לעומת זאת שלב המאפשר להערכת תנועתיות הזרע. עם זאת, גורם מגביל של תנועתיות פרמטר הוא קצב המסגרות של מצלמת הוידאו. Spermatozoa בודדים מסלולים מבוססים על spermatozoa ראש centroid המיקום במסגרות רצופים של הקלטות וידאו, אשר הוא מתואם עם התנועה השוטוניים דפוסי3,9,10, 11. הפרמטרים העיקריים קינטי נמדד הם מהירות הקו הישר (וי), מהירות לאכסדרות (צ’לו) נתיב ממוצע מהירות (ידינו). וי הוא המרחק בין נקודת המוצא מובילים שגבה את spermatozoa מחולק זמן. צ’לו היא המהירות האמיתית לאורך המסלול נלקחה על ידי spermatozoa. ידינו הוא המהירות לאורך נתיב מוחלקים נגזרת של המסלול. פרמטרים אלה מאפשרים פרטים קינטי נוספים, לרבות ליניאריות (לין), יושר (STR), התנודדות (WOB), מדידות מכות כמו משרעת של התנועה הראשי לרוחב (ALH) ו ביט-צלב תדר (BCF)4,10.
מערכת ניתוח זרע ששימש במקור עבור יונקים, אחת הדרישות של המערכת לפעול טמפרטורת הגוף של התורם (כ 37 מעלות צלזיוס). תוכנה זו יכולה לשמש גם זני דגים; למרות, יש צורך לבצע כמה עיבודים כדי להפחית את השגיאה של תוצאות ניתוח זרע. במינים מסוימים דג ‘, כגון סלמונאיים: צלופח8,12, ההפריה מתרחשת בטמפרטורה נמוכה (בסביבות 4 ° C)2,4. לפיכך, התקני קירור צריכה להיות מפותחת כדי להימנע תנאי עבודה לא נוח. בנוסף, דג spermatozoa immotile בנוזל הזרע, לדרוש מכת אוסמוטי להפעלת תנועתיות. מים מתוקים מינים, המדיום activator צריך להיות osmolality היפוטוניק, בעוד מינים ימיים המדיום צריך להיות hypertonic. עם זאת, עבור מינים מסוימים, כמו סלמונאיים:, ריכוז יון יכול גם להיות חשוב3,4,9. לאחר ההפעלה, דגים זרע מאופיין על ידי ירידה מהירה של תנועתיות (פחות מ- 2 דקות)13,14 ו בדחיסות גבוהה, להיות חיוני כדי לקבוע את קצב המסגרות אופטימלית להשיג נתונים אמינים15.
מטרות המחקר הן לעצב וליישם מערכות קירור עבור דגימות זרע של דג. בנוסף, פרוטוקול זה מגדיר כיצד לקבוע את המחירים מסגרת אופטימלית עבור הקמת פרוטוקולים סטנדרטיים בהתאם למין. השימוש בפרוטוקול זה פותח דלתות חדשות בהקשר של הערכת הזרע דגים, משתמש הצלופח אירופה כמודל.
Protocol
Representative Results
Discussion
התוכנה ניתוח זרע בשימוש פרוטוקול זה שימש על ידי חוקרים ברחבי העולם עבור מינים שונים, כולל דגים. עם זאת, דגים יש מספר תכונות ספציפיות יכול להשפיע על ההערכה זרע. דגים spermatozoa הראו מהירות גבוהה ברגע של ההפעלה אשר מסרב במהירות, מוביל זמן קצר של תנועתיות לאחר ההפעלה. חוץ מזה, הטמפרטורה של רבייה היא…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט קיבל מימון העמותה עלות (מזון, חקלאות עלות פעולה FA1205: AQUAGAMETE, ותוכנית של האיחוד האירופי אופק 2020 מחקר וחדשנות תחת מארי Sklodowska-קירי פרויקט מראה מרהיב (GA לא 642893). ברצוננו להודות הצוות המדעי של PROiSER, במיוחד כדי שהתלמיד אלברטו וונדרל ברנאבאו עבור השתתפותו הפעילה הקלטת וידאו של פרויקט זה.
Materials
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
Referências
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout – the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis?. Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O’Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations’ structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
