Fisk Sperm vurdering ved hjelp av programvare og kjøling enheter
Summary
Nåværende protokollen beskriver en fremgangsmåte av fisk sperm vurdering computer-assistert sperm analyse og kjøling enheter. Programvaren gir en rask, nøyaktig og kvantitativ analyse av fisk sperm kvalitet basert på spermatozoa motilitet, som kan være nyttig verktøy i akvakultur å forbedre reproduksjon suksess.
Abstract
For Kjønnscelle kvalitet evaluering finnes det nyskapende, rask og kvantitative teknikker som kan gi nyttig informasjon for akvakultur. En av de oftest måles er Spermiemotilitet datastyrte systemer for sperm analyse ble utviklet for å måle flere parametere.
I utgangspunktet ble denne datateknologi utviklet for pattedyrarter, selv om det kan også brukes for fisk sperm analyse. Fisken har bestemte funksjoner som kan påvirke sperm vurdering som en kort motilitet tid etter aktivering og, i noen tilfeller tilpasning til lavere temperaturer. Derfor er det nødvendig å endre både programvare og maskinvare komponenter slik at motilitet analyse mer effektiv for fisk sperm analyse. Pattedyr sæd brukes varmeplaten å opprettholde optimal temperatur spermatozoa. Men for noen fiskearter er det en fordel å bruke en lavere temperatur for å forlenge varigheten av motilitet, siden sperm forblir aktive for mindre enn 2 minutter. Kjøling enheter er derfor nødvendig å kjøle samples ved konstant temperatur over tid analyse, inkludert på optisk mikroskopet. Denne protokollen beskriver analyse av fisk Spermiemotilitet programvare for sperm analyse og nye kjøleenhetene å optimalisere resultatene.
Introduction
Effekten av reproduksjon, avhenger av kvaliteten på begge gameter (egg og sperm)1,2. Dette er den viktigste faktoren som bidrar til vellykket befruktning, slik at utviklingen av levedyktig avkom3,4. Praktisk evaluering av Kjønnscelle kvalitet er det beste verktøyet for å definere fruktbarhet potensialet i en prøve.
Blande sperm fra flere menn er en vanlig praksis i produksjon av mange kommersielle dyrearter4. Men sperm variasjon mellom menn kan føre til sæd konkurranse, og derfor ikke alle menn like bidrar til gener5. I denne forstand er riktig evaluering av personlige ejakulere/spermatozoa funksjoner, for eksempel motilitet, grunnleggende for få diskriminerende informasjon om individuelle mannlig fertilitet potensielle. Direkte observasjon av Spermiemotilitet kan gi unøyaktige og subjektive data som det krever tid og erfaring, som fører til manglende konsistens og uforlikelighet resultater6,7. Det er imidlertid mange nyskapende, rask og kvantitative teknikker som kan gi et pålitelig sperm kvalitet analyse2,4.
Computer-assistert sperm analyse ble utviklet for å gi nøyaktige data om sperm kvalitet8. Denne teknologien inkluderer utvikling av programvare som er knyttet til fase kontrast mikroskop som lar vurdering av Spermiemotilitet. En begrensende faktor motilitet parameteren er imidlertid bildefrekvens videokameraet. Individuelle spermatozoa baner er basert på spermatozoa leder centroid posisjon i påfølgende rammer på videoopptak, som er forbundet med flagellar bevegelse mønstre3,9,10, 11. de viktigste kinetic parametrene målt er lineære hastighet (VSL), beregner hastighet (VCL) og gjennomsnittlig banen hastighet (VAP). VSL er avstanden mellom start- og sluttpunktet tatt av spermatozoa delt tid. VCL er reelle hastigheten langs nøyaktige banen tatt av spermatozoa. VAP er hastigheten langs en avledet buede banen til banen. Disse parametrene kan kinetic tilleggsinformasjon, inkludert linearitet (LIN), rett linje (STR), vingle (WOB) og slo målinger som amplituden av hodet vridning (ALH) og beat-cross frekvens (milliarder Kubikkfot)4,10.
Sperm analyse systemet ble opprinnelig brukt til pattedyrarter, og et av kravene for systemet er å operere på kroppstemperaturen av donor (ca 37 ° C). Denne programvaren kan også brukes til fiskearter; Selv om det er nødvendig å gjøre noen tilpasninger å redusere antallet sperm analyseresultater. I enkelte fiskearter, som laks og ål8,12, oppstår befruktning ved lav temperatur (rundt 4 ° C)2,4. Dermed skal kjøleenheter utvikles for å unngå ubehagelig arbeidsforhold. I tillegg fisk spermatozoa er immotile i seminal væske og krever en osmotisk sjokk å aktivere motilitet. For ferskvannsarter ha aktivator mediet hypotonisk osmolality, mens for marine arter medium bør være hypertonic. Men for noen arter kan som laks, konsentrasjonen også være viktig3,4,9. Etter aktivisering, er fisk sperm preget av en svekkelse av motilitet (mindre enn 2 min)13,14 og høy hastighet, blir viktig å fastslå den optimale bildefrekvensen for å få pålitelige data15.
Målene med denne studien er å designe og bruke kuldeanlegg for fisk sperm prøver. I tillegg definerer denne protokollen fastslå de optimale bildefrekvens for etablering av standardprotokoller avhengig av arten. Bruk av denne protokollen åpner nye dører i sammenheng med fisk banebrytende evaluering, med europeisk som modell.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sperm analyseprogramvare brukes i denne protokollen er brukt av forskere over hele verden for ulike arter, inkludert fisk. Men har fisk noen spesielle funksjoner som kan påvirke sperm vurdering. Fisk spermatozoa viste høy hastighet i øyeblikket aktivisering hvilke avtar raskt og fører til kort tid for motilitet etter aktivering. Dessuten temperaturen på reproduksjon er avhengig av arter, og i noen tilfeller kunne rundt 4 ° C2,4,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette prosjektet har mottatt finansiering fra kostnaden Association (mat og landbruk pris handling FA1205: AQUAGAMETE og EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon programmet under Marie Sklodowska-Curie prosjekt imponere (GA ingen 642893). Vi vil gjerne takke vitenskapelige team av PROiSER, spesielt for studenten Alberto Vendrell Bernabéu, hans aktiv deltakelse i videoinnspillingen av dette prosjektet.
Materials
| Human Chorionic Gonadotropin | Argent Chemical Laboratories | hCG | Hormone |
| Benzocaine | Merck | E1501 Sigma | Anesthesia |
| sodium bicarbonate | Merck | S5761 Sigma | P1 medium |
| sodium chloride | Merck | 1.06406 EMD Millipore | P1 medium |
| magnesium chloride | Merck | 1374248 USP | P1 medium |
| potassium chloride | Merck | P3911-500G | P1 medium |
| calcium chloride | Merck | C7902-500G | P1 medium |
| commercial salt | Aqua Medic | Meersalz | Activator solution |
| BSA | Merck | 05470 Sigma | Activator solution |
| Falcon tubes 15 ml | Merck | T1943-1000EA | |
| Falcon tubes support | Merck | R5651-5EA | |
| Eppendorfs | Merck | T9661-1000EA | |
| Micropipet 20 µl | Gilson | PIPETMAN® Classic | |
| Micropipet 10 µl | Merck | Z683787-1EA | |
| Tips for micropipets 20 µl | Merck | Z740030-1000EA | |
| Tips for micropipets 10 µl | Merck | Z740028-2000EA | |
| Spermtrack | PROiSER | Counting chamber | |
| TruMorph | PROiSER | TruMorph | |
| Microscope UB 200i Serie | PROiSER | Microscope | |
| Cooler plate | PROiSER | Prototype | |
| Cooler block | PROiSER | Prototype | |
| ISAS v1 | PROiSER | ISAS | Software |
Referências
- Kime, D. E., et al. Use of computer-assisted sperm analysis (CASA) for monitoring the effects of pollution on sperm quality of fish; application to the effects of heavy metals. Aquatic Toxicology. 36, 223-237 (1996).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Bobe, J., Labbé, C. Egg and sperm quality in fish. General and Comparative Endocrinology. 165, 535-548 (2010).
- Rurangwa, E., Kime, D. E., Ollevier, F., Nash, J. P. The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture. 234, 1-28 (2004).
- Bekkevold, D., Hansen, M. M., Loeschcke, V. Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Molecular Ecology. 11, 91-102 (2002).
- Chong, A. P., Walters, C. A., Weinrieb, S. A. The neglected laboratory test: the semen analysis. Journal of Andrology. 4, 280-282 (1983).
- Overstreet, J. W., Katz, D. F., Hanson, F. W., Fonesca, J. R. Laboratory tests for human male reproductive risk assessment. Teratogenesis, Carcinogenesis, and Mutagenesis. 4, 67-82 (1984).
- Gallego, V., et al. Standardization of European eel (Anguilla anguilla) sperm motility evaluation by CASA software. Theriogenology. 79, 1034-1040 (2013).
- Fauvel, C., Suquet, M., Cosson, J. Evaluation of fish sperm quality. Journal of Applied Ichthyology. 26, 636-643 (2010).
- Mortimer, S. T., Schoëvaërt, D., Swan, M. A., Mortimer, D. Quantitative observations of flagellar motility of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 12, 1006-1012 (1997).
- Bompart, D., et al. CASA-Mot technology: How results are affected by the frame rate and counting chamber. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Vladić, T., Järvi, T. Sperm motility and fertilization time span in Atlantic salmon and brown trout – the effect of water temperature. Journal of Fish Biology. 50, 1088-1093 (1997).
- Rurangwa, E., Volckaert, F. A. M., Huyskens, G., Kime, D. E., Ollevier, F. Quality control of refrigerated and cryopreserved semen using computer-assisted sperm analysis (CASA), viable staining and standardizes fertilisation in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology. 55, 751-769 (2001).
- Cosson, J., et al. Marine fish spermatozoa: racing ephemeral swimmers. Reproduction. 136, 277-294 (2008).
- Castellini, C., Dal Bosco, A., Ruggeri, S., Collodel, G. What is the best frame rate for evaluation of sperm motility in different species by computer-assisted sperm analysis?. Fertility and Sterility. 96, 24-27 (2011).
- Soler, C., et al. A holographic solution for sperm motility analysis in boar samples. Effect of counting chamber depth. Reproduction, Fertility and Development. , (2018).
- Elliot, F. I., Sherman, J. K., Elliot, E. J., Sullivan, J. J. A photo method of measuring sperm motility. Journal of Animal Science. 37, 310 (1973).
- Katz, D. F., Dott, H. M. Methods of measuring swimming speed of spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility. 45, 263-272 (1975).
- Liu, Y. T., Warme, P. K. Computerized evaluation of sperm cell motility. Computers and Biomedical Research. 10, 127-138 (1977).
- Jecht, E. W., Russo, J. J. A system for the quantitative analysis of human sperm motility. Andrologia. 5, 215-221 (1973).
- Holt, W. V., Palomo, M. J. Optimization of a continuous real-time computerized semen analysis system for ram sperm motility assessment, and evaluation of four methods of semen preparation. Reproduction, Fertility and Development. 8, 219-230 (1996).
- Stephens, D. T., Hickman, R., Hoskins, D. D. Description, validation, and performance characteristics of a new computer-automated sperm motility analysis system. Biology of Reproduction. 38, 577-586 (1988).
- Mortimer, D., Goel, N., Shu, M. A. Evaluation of the CellSoft automated semen analysis system in a routine laboratory setting. Fertility and Sterility. 50, 960-968 (1988).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Kinematics of capacitating human spermatozoa analysed at 60 Hz. Human Reproduction. 10, 873-879 (1995).
- Holt, W. V., O’Brien, J., Abaigar, T. Applications and interpretation of computer-assisted sperm analyses and sperm sorting methods in assisted breeding and comparative research. Reproduction, Fertility and Development. 19, 709-718 (2007).
- Gill, H. Y., Van Arsdalen, K., Hypolote, J., Levin, R., Ruzich, J. Comparative study of two computerized semen motility analyzers. Andrologia. 20, 433-440 (1988).
- Jasko, D. J., Lein, D. H., Foote, R. H. A comparison of two computer-assisted semen analysis instruments for the evaluation of sperm motion characteristics in the stallion. Journal of Andrology. 11, 453-459 (1990).
- Vantman, D., Koukoulis, G., Dennison, L., Zinaman, M., Sherins, R. Computer-assisted semen analysis: Evaluation of method and assessment of the influence of sperm concentration on linear velocity determination. Fertility and Sterility. 49, 510-515 (1988).
- Kime, D. E., et al. Computer-assisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comparative Biochemistry and Physiology – Part C: Toxicology & Pharmacology. 130, 425-433 (2001).
- Scherr, T., et al. Microfluidics and numerical simulation as methods for standardization of zebrafish sperm cell activation. Biomedical Microdevices. 17, 65-75 (2015).
- Mortimer, S. T., Swan, M. A. Effect of image sampling frequency on established and smoothing-independent kinematic values of capacitating human spermatozoa. Human Reproduction. 14, 997-1004 (1999).
- Hoogewijs, M. K., et al. Influence of counting chamber type on CASA outcomes of equine semen analysis. Equine Veterinary Journal. 44, 542-549 (2012).
- Soler, C., et al. Effect of counting chamber on seminal parameters, analyzing with the ISASv1®. Revista Internacional de Andrología. 10, 132-138 (2012).
- Didion, B. A. Computer-assisted semen analysis and its utility for profiling boar semen samples. Theriogenology. 70, 1374-1376 (2008).
- David, G., Serres, C., Jouannet, P. Kinematics of human spermatozoa. Gamete Research. 4, 83-95 (1981).
- Björndahl, L. What is normal semen quality? On the use and abuse of reference limits for the interpretation of semen results. Human Fertility (Cambridge). 14, 179-186 (2011).
- Verstegen, J., Iguer-ouada, M., Onclin, K. Computer-assisted semen analyzers in andrology research and veterinary practice. Theriogenology. 57, 149-179 (2002).
- Alavia, S. M. H., Cosson, J. Sperm motility in fishes. I. Effects of temperature and pH: a review. Cell Biology International. 29, 101-110 (2005).
- Islam, M. S., Akhter, T. Tale of Fish Sperm and Factors Affecting Sperm Motility: A Review. Advancements in Life Sciences. 1, 11-19 (2011).
- Dadras, H., et al. Analysis of common carp Cyprinus carpio sperm motility and lipid composition using different in vitro temperatures. Anim. Reprod. Sci. 180, 37-43 (2017).
- Soler, C., García, A., Contell, J., Segervall, J., Sancho, M. Kinematics and subpopulations’ structure definition of blue fox (Alopex lagopus) sperm motility using the ISASV1 CASA system. Reproduction in Domestic Animals. 49, 560-567 (2014).
- Vásquez, F., Soler, C., Camps, P., Valverde, A., GarcíaMolina, A. Spermiogram and sperm head morphometry assessed by multivariate cluster analysis results during adolescence (12-18 years) and the effect of varicocele. Asian Journal of Andrology. 18, 824-830 (2016).
- Soler, C., et al. Dog sperm head morphometry: its diversity and evolution. Asian Journal of Andrology. 19, 149-153 (2017).
- Valverde, A., et al. Morphometry and subpopulation structure of Holstein bull spermatozoa: variations in ejaculates and cryopreservation straws. Asian Journal of Andrology. 18, 851-857 (2016).
