En roman In Vitro sår helbredelse analysen for å vurdere celle migrasjon
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å evaluere effekten av peptider på overføringen av bronkial epitelceller. Denne metoden gir rask og svært reproduserbar obtainment av kvantitative data på hastigheten av celle migrasjon og såret nedleggelse.
Abstract
Formålet med dette arbeidet er å vise en roman metode for å vurdere muligheten for noen immunmodulerende molekyler, som antimikrobielle peptider (ampere), å stimulere celle migrasjon. Viktigere, er celle migrasjon en hastighetsbegrensning hendelse under sårhelende prosessen å reetablere integritet og normal funksjon av vev lag etter skader. Fordelen med denne metoden over klassisk analysen, som er basert på en manuelt laget ripe i en celle monolayer, er bruk av spesielle silikon kultur setter gir to avdelinger for å opprette en celle-fri pseudo såret felt med en godt definert bredde (500 μm ). I tillegg, på grunn av en automatiserte image analyse plattform er det mulig å raskt få kvantitative data på hastigheten på såret nedleggelse og celle migrasjon. Mer presist, vises effekten av to frosk-hud forsterkere på overføringen av bronkial epitelceller. Videre, forbehandling av disse cellene med bestemte hemmere vil gi informasjon om molekylære mekanismer underliggende slike hendelser.
Introduction
Det er hovedsakelig kjent at sårheling i dyr er en grunnleggende prosess å reetablere integritet og normal funksjon av vev lag etter skade1. Til tross for epithelial overflater utsatt for eksterne miljøet (f.eks, hud, luftveier, og mage traktater) danner en beskyttende barriere fra fysiske og kjemiske fornærmelser, dannelsen av sår oppstår lett, spesielt etter kirurgi eller mikrobielle infeksjoner2. Eksempel fører kolonisering av lungevev av opportunistiske bakteriell patogen Pseudomonas aeruginosa, spesielt i cystisk fibrose (CF) lider, til skade av luftveiene epitel med påfølgende respirasjonssvikt3, 4. Sårheling er en kompleks vert reparasjon mekanisme for å gjenopprette en skadet vev5normal arkitektur. Det er preget av første betennelse, etterfulgt av en fornyelse perioden omfatter epithelialization, angiogenese og vev remodeling med kollagen produksjon og celle differensiering6,7,8 . Sikre epithelial integritet og kontrollere mikrobiell spredning, produsere alle levende organismer forsvar molekyler, inkludert antimikrobielle peptider (ampere)9,10. Såret helbredelsesprosessen er svært vanskelig å simulere i vitro skyldes mangel på celle rusk og komplekse interaksjoner mellom ulike celletyper. Men i vitro evne til et peptid å akselerere nedleggelsen av en pseudo såret ved å stimulere migrering av epitelceller er et tegn på sin evne til å helbrede en kompromittert epitel. Faktisk celle migrasjon er en hastighetsbegrensning hendelse i sårheling, og studere faktorer som kan påvirke celle migrasjon vil bidra til å mål terapi for forbedret sårtilheling.
Her, gis en svært reproduserbar eksperimentelle analysen basert på spesielle silikon kultur setter å vurdere celle migrasjon i vitro. Den er basert på etablering av et 500 μm gap (pseudo såret) på en confluent celle monolayer. Cellene på kanten av kunstige “såret” feltet starter overføring til celle-fri området, forming nye celle-celle kontakter. Sett inn kultur representerer et nytt verktøy for rask sårheling eksperimenter. To reservoarer med en 500 μm vegg tilbys, og de kan være riktig plassert i en 3 cm rett plate eller av en 12-vel plate. Fylle hvert kammer av sette med en celle suspensjon kan cellene vokse i hver angitte området til samløpet, mens fjerning av sette vil skape en ren celle-fri avstand på ca 500 μm (samme bredde som separasjon veggen). Et riktig celle kultur medium med en test forbindelse kan deretter legges til parabolen plate/godt. Etterpå kan gapet nedleggelsen visualiseres i forskjellige tidsintervaller under en invertert mikroskop, fortrinnsvis en utstyrt med et videokamera for bildeopptak. Til slutt, måling av endringer i celle-dekket området av webbaserte automatiserte image analyseprogrammet tillater kvantifisering av hastigheten på såret nedleggelse og celle migrasjon. Total, denne metoden er et skritt fremover med hensyn til klassisk analysen, der en ripe gjøres manuelt ved incising confluent celle monolayers med en steril nål eller en pipette tips11. Faktisk den siste fremgangsmåten kan ødelegge plast bunnen av parabolen plate/godt og overflatebehandlingen, opprette rynker. I tillegg har “såret” området ikke en godt definert bredde langs hele lengden av gapet, som dette er svært avhengig av stort trykk som brukes av forskere til pinne-spissen. Videre kan forskyves cellene danne klumper av levende og døde celler på kantene av scratch; Videre kan spredning av levende celler i området “såret” påvirke hastigheten av celle migrasjon, genererer ikke reproduserbare resultater12.
I tillegg takket være en ripe bildet analyse plattform, kan brukere raskt motta (i minutter) kvantitative data på hos de merkede cellene uten nødvendigheten av å skaffe ekstra programvare. Denne plattformen er dugelig å analysere fase kontrast mikroskopi bilder av lav (~ 5 X), medium (~ 10 X) og høy (~ 20 X) forstørrelse. Etter å ha lastet en zip-fil med bilder (i *.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff format) utføres analyse automatisk for å generere en Sammendrag-fil som viser prosentandelen av både celle-dekket områder og bunnen og hastigheten på cellen migrasjon, med forskjellige tidsintervaller.
I dette arbeidet, ved hjelp av en frosk-hud AMP-avledet dvs Esc(1-21) og dens diastereomer Esc(1-21) – 1 c13og en bronkial cellen linje uttrykke funksjonelle CF transmembrane konduktans regulator (CFTR)14,15, et eksempel på peptid-indusert celle migrasjon med ubehandlet (kontroll) eksempler er gitt. Merk at airway epitel og CFTR spille en avgjørende rolle i å opprettholde lungefunksjonen og såret reparasjon16. Videre gjennom selektiv hemmere (f.eks AG1478)17 av epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), bevis på at overføringen av bronkial celler forårsaket av de nevnte peptidene innebærer aktivering av EGFR12, 18 er rapportert.
Oppsummert er er målet med denne prosedyren å vise hvordan bruken av slike silikon kultur setter representerer en rask og lett tilgjengelig analysen å nøyaktig fastslå migrering av tilhenger celler (f.eks bronkial epitelceller) og den molekylære mekanismer som styrer slike hendelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Celle migrasjon er en viktig prosess i mange fysiologiske og patologiske arrangementer inkludert sårheling, embryonale utvikling og kreft metastasering. Den grunnleggende prosedyren å studere celle migrasjon i vitro innebærer: (i) etableringen av en celle monolayer, (ii) produksjon av et pseudo sår i confluent laget av celler, (iii) erobringen av bilder på ulike tidsintervaller til såret nedleggelse er nådd , og (iv) analyse av bildesekvens for å kvantifisere overføringshastighet de valgte cellene.
…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av finansiering fra Sapienza Universitetet i Roma og italienske cystisk fibrose Research Foundation (Project FFC #11/2014 vedtatt av FFC delegasjoner fra Siena, Sondrio Valchiavenna, Cerea Il Sorriso di Jenny og Pavia). Del av dette arbeidet ble også støttet av FILAS Grant Prot. FILAS-RU-2014-1020.
Vi er takknemlige for Dr. Loretta Ferrera (U.O.C. Genetica Medica, Istituto Giannina Gaslini, Genova, Italia) for å tilby bronkial epitelceller.
Materials
| Minimal essential medium (MEM) | Euroclone | ECB2071L | Warm in 37 °C water bath before use |
| Glutamine | Euroclone | ECB3000D | |
| Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS) | Euroclone | ECS0180DH | |
| Penicillin and Streptomycin | Euroclone | ECB3001D | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| Trypsin/EDTA 1X in PBS | Euroclone | ECB3052D | Warm at room temperature before use |
| DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DPBS with calcium and magnesium (PBS) | Sigma-Aldrich | D8662 | |
| Ibidi Culture-Insert 2 well | Ibidi | 80209 | |
| Wimasis Image Analysis | Ibidi | 30002 | |
| PRISM software | GraphPad | version 6.0 |
Referências
- Enyedi, B., Niethammer, P. Mechanisms of epithelial wound detection. Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).
- Kujath, P., Kujath, C. Complicated skin, skin structure and soft tissue infections – are we threatened by multi-resistant pathogens?. Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).
- Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O’Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway. Pulm Pharmacol Ther. 21, 595-599 (2008).
- Chiappini, E., Taccetti, G., de Martino, M. Bacterial lung infections in cystic fibrosis patients: an update. Pediatr Infect Dis J. 33, 653-654 (2014).
- Mangoni, M. L., McDermott, A. M., Zasloff, M. Antimicrobial peptides and wound healing: biological and therapeutic considerations. Exp Dermatol. 25, 167-173 (2016).
- Lau, K., Paus, R., Tiede, S., Day, P., Bayat, A. Exploring the role of stem cells in cutaneous wound healing. Exp Dermatol. 18, 921-933 (2009).
- Hu, M. S., et al. Tissue engineering and regenerative repair in wound healing. Ann Biomed Eng. 42, 1494-1507 (2014).
- Ramot, Y., et al. The role of PPARgamma-mediated signalling in skin biology and pathology: new targets and opportunities for clinical dermatology. Exp Dermatol. 24, 245-251 (2015).
- Lai, Y., Gallo, R. L. AMPed up immunity: how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense. Trends Immunol. 30, 131-141 (2009).
- Zasloff, M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature. 415, 389-395 (2002).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3, 107-124 (2011).
- Di Grazia, A., et al. The frog skin-derived antimicrobial peptide esculentin-1a(1-21)NH2 promotes the migration of human HaCaT keratinocytes in an EGF receptor-dependent manner: a novel promoter of human skin wound healing?. PLoS One. 10, e0128663 (2015).
- Di Grazia, A., et al. D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions. Amino Acids. 47, 2505-2519 (2015).
- Cappiello, F., et al. Esculentin-1a-derived peptides promote clearance of Pseudomonas aeruginosa internalized in bronchial cells of cystic fibrosis patients and lung cell migration: biochemical properties and a plausible mode of action. Antimicrob Agents Chemother. 60, 7252-7262 (2016).
- Bebok, Z., et al. Failure of cAMP agonists to activate rescued deltaF508 CFTR in CFBE41o- airway epithelial monolayers. J Physiol. 569, 601-615 (2005).
- Trinh, N. T., et al. Improvement of defective cystic fibrosis airway epithelial wound repair after CFTR rescue. Eur Respir J. 40, 1390-1400 (2012).
- Gan, H. K., et al. The epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase inhibitor AG1478 increases the formation of inactive untethered EGFR dimers. Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806. J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).
- Tokumaru, S., et al. Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37. J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).
- Tjabringa, G. S., et al. The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor. J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).
- Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).
