Développement d’un test In Vitro pour doser les progéniteurs et souches hématopoïétiques cellules (HSPCs) dans le développement des embryons de poisson-zèbre
Summary
Nous présentons ici une méthode simple pour quantifier les cellules hématopoïétiques souches et progénitrices (HSPCs) chez le poisson zèbre embryonnaire. HSPCs de poisson-zèbre dissocié sont plaqués en méthylcellulose facteurs favorables, DIFFERENCIATION en sang mature. Cela permet la détection du sang des défauts et permet aux médicaments de dépistage doit être réalisée facilement.
Abstract
L’hématopoïèse est un processus cellulaire essentiel dans lequel des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) se différencient en la multitude de lignées cellulaires qui composent le sang mature. Isolement et identification de ces HSPCs est difficile parce qu’ils sont définis ex post facto; ils ne peuvent être définis qu’après leur différenciation en lignées cellulaires spécifiques. Dans les dernières décennies, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle pour étudier l’hématopoïèse. Développent ex uterodes embryons de poisson-zèbre et par fécondation après 48 h (hpf) ont généré définitif HSPCs. tests afin d’évaluer la différenciation HSPC et capacités de prolifération ont été développées, utilisant la transplantation et suivantes reconstitution du système hématopoïétique en plus de la visualisation des lignées transgéniques spécialisées avec la microscopie confocale. Cependant, ces essais sont coût prohibitif, techniquement difficile et chronophage pour de nombreux laboratoires. Développement d’un modèle in vitro pour évaluer HSPCs serait rentable, plus rapide, et présentes moins de difficultés par rapport à précédemment décrit les méthodes, permettant aux laboratoires d’évaluer rapidement des écrans mutagenèse et de drogues qui affectent la biologie HSPC. Cette analyse roman in vitro pour évaluer HSPCs est réalisée par les embryons de poissons zèbres entier de placage dissociée et ajout des facteurs exogènes qui favorisent seulement la CSPH différentiation et la prolifération. Embryons sont dissociés en cellules individuelles et plaqués avec HSPC conciliants facteurs stimulants de colonie qui les amènent à générer des unités formant colonies (UFC) qui proviennent d’une cellule unique ancêtre. Ces tests devraient permettre un examen plus attentif des voies moléculaires responsables de la prolifération, la différenciation et la réglementation, ce qui permettra aux chercheurs de comprendre les fondements de l’hématopoïèse vertébré et son dérèglement HSPC au cours de la maladie.
Introduction
L’hématopoïèse est le processus de fabrication de la multitude de cellules sanguines matures nécessaires à la survie de l’organisme. C’est un processus de développement clé qui implique la différenciation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) dans une variété de types de cellules développemental restreinte qui composent le sang mature. Ces CSH doit se renouveler afin que le système n’est jamais épuisé et ils doivent persister depuis le début du développement embryonnaire jusqu’à la mort. Chez les vertébrés, la constante différenciation et la prolifération des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) sont nécessaires pour remplir adéquatement la majorité des cellules sanguines qui sont post-mitotiques et être recyclé tous les jours. CSH génère des cellules sanguines matures en premier différenciant en sous-ensembles de cellules progénitrices restreinte ; commune cellules souches lymphoïdes (SPDP)1, qui finit par produire des cellules T et B NK et commune progéniteurs myéloïdes (CMPs)2 qui génèrent les granulocytes, les érythrocytes, les macrophages et les mégacaryocytes. Ces cellules souches se sont engagés à générer des lignées cellulaires spécifiques et davantage se différencient en plus progéniteurs développemental restreints tels que les progéniteurs érythroïdes myéloïde (députés) qui génèrent des érythrocytes et des plaquettes ou des granulocytes progéniteurs de macrophages (BPF) qui génèrent des basophiles, éosinophiles, neutrophiles et les macrophages2. Identifier et isoler ces cellules souches permettent l’identification d’importants mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation hématopoïétique et de nombreuses maladies hématopoïétiques telles que la leucémie se posent lorsque ces cellules progénitrices ne pas correctement faire la différence.
Dans les dernières décennies, le système de modèle de poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un outil de recherche d’études hématopoïétiques embryonnaires et adultes. Poisson zèbre se prêtent à des analyses génétiques et sont les espèces de vertébrés modèle phylogénétiquement plus bas qui ont une vascularisation similaire et le système hématopoïétique aux humains. Développent des embryons de poisson-zèbre ex utero, et dans les 48 heures après la fécondation (hpf) générer HSPCs3,4,5,6,7,8. Poisson zèbre sont également très fécondes, les femelles portant sur 100 oeufs dans une seule couvée, permettant la réplication expérimentale et de vastes échantillons. Des embryons de poisson-zèbre sont optiquement transparentes, permettant une visualisation microscopique du système hématopoïétique. Plusieurs lignées transgéniques fluorescentes de poisson-zèbre marquage autorenouveler comme runx1: EGFP poisson9, cd41: EGFP pêcher10, et kdrl :mCherry ; CMJN: GFP3 double-positifs animaux, permettent pour la visualisation en temps réel de HSC émergence et l’expansion in vivo3,4,7,8, 9. Génération rapide temps et développement ex utero du poisson-zèbre a mené à son utilisation en mutagénèse études11,12,13,14,15 et drogues le dépistage de16,17,18,19,20 pour les composés qui sont thérapeutiques prometteuses pour troubles du sang humain. Dans l’ensemble, conservation du système hématopoïétique, la présence et le développement facile des lignées transgéniques et l’heure de régénération rapide a fait le poisson-zèbre, un modèle peu coûteux, rapide, flexible et idéal pour les études hématopoïétiques.
Nombreuses méthodes d’isolement et CSH ont été développés dans des systèmes hématopoïétiques chez les mammifères. Les enquêteurs peuvent utiliser une combinaison de récepteurs membranaires à Marc autorenouveler21,22,23,24, en plus d’exploiter la capacité des CSH à efflux colorant25,26. Après qu’ils sont étiquetés, cellule activée par fluorescence triant (FACS) permet leur séparation physique. Ce qui prouve qu’une cellule est un HSC nécessite irradier un animal hôte pour détruire HSPCs endogènes, repiquage autorenouveler putatif et en observant les reconstitution à long terme, lignée multiples de tous matures des types de cellules sanguines. Ces tests fonctionnent bien chez la souris, comme il y a de nombreux anticorps de surface cellulaire contre les cellules hématopoïétiques et souches de souris consanguines qui facilitent le système immunitaire correspondant à la transplantation. Cependant, quelques poissons zèbres hématopoïétiques anticorps de surface cellulaire ont été généré27, empêchant l’identification et l’isolement des CSH. La façon la plus courante pour marquer et isoler le poisson-zèbre CSH est avec des animaux transgéniques, selon lequel une séquence promotrice de la spécificité cellulaire est le moteur expression de la protéine fluorescente. Études ont visualisé et énuméré les CSH dans la paroi ventrale de l’aorte dorsale au microscope utilisant cette technique3,4,8,9. Autres laboratoires ont généré des souches clonales du poisson-zèbre28,29 et ont effectué des greffes réussies dans animaux appariés MHC30. Toutefois, ces techniques sont inabordable pour de nombreux laboratoires, sont techniquement difficiles et demandent beaucoup de temps. Pour résoudre ces problèmes, les laboratoires ont généré plusieurs essais in vitro pour tester la présence, le taux de prolifération et la capacité de différenciation des HSPCs31,32,33, 34,35,,36. Ces tests montrent la prolifération et la différenciation des HSPCs in vitro31,32,33,34,35,36, le sauvetage des hématopoïétiques défauts36et une méthode efficace pour découvrir et tester les cytokines33,34,35. Ils ont également été utilisés pour identifier les gènes responsables de la CSPH biologie31,32. Dans cette étude, nous prenons ces tests un peu plus loin, ce qui permet le dosage des HSPCs dans un embryon de poisson zèbre. Ces tests peuvent également être utilisées pour quantifier le nombre de HSPCs chez les animaux mutants et animaux traités avec des médicaments hématopoïétiques sans interruption. Essentiellement, ces tests sont rapides, présentes quelques difficultés techniques et des moyens peu coûteux pour quantifier les numéros HSPC, examiner leur prolifération et enquêter sur les blocs dans la différenciation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le système de modèle de poisson-zèbre est devenu un modèle efficient, efficace et peu coûteux pour étudier l’hématopoïèse vertébré primitif et définitive. Génération de tests qui sont rapides, peu coûteux et présenter quelques difficultés techniques peut être utilisée pour les essais de petites molécules, analysant les embryons mutants et élucider les voies moléculaires importantes pour la biologie HSPC. In vitro un placage de HSPCs de poisson-zèbre adulte est une méthode efficace pour …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financé par le National Institutes of Health (NIH : K01-DK087814-01 a 1 à D.L.S.), Program de la California State University pour l’éducation et de recherche en biotechnologie (CSUPERB : contrôle moléculaire de la Niche hématopoïétiques vertébrés à D.L.S.) et du Bureau des études supérieures au California State University Chico (à A.C.B.).
Materials
| 10% Bovine Serum Albumin in Iscove's MDM | StemCell Technologies | 9300 | |
| DPBS (10x) with Calcium2+ and Magnesium2+ | Life Technologies | 14080-055 | |
| HyClone PBS (1x) | GE Healthcare Life Sciences | sh30256.01 | |
| DMEM 500 mL | Corning CellGrow | 10-017-CV | |
| Ham's F12 500 mL | Corning CellGrow | 10-080-CV | |
| FBS 500 mL | Gemini Bio-Products | 100-108 | |
| HEPES 100 mL (1 M) | Gibco life technologies | 15-630-080 | |
| Penicillin/streptomycin (5000 U/mL and 5000 mg/mL) with L-Glutamine (200 mM) |
Corning Mediatech | 30-009-CI | |
| Gentamycin Sulfate 10 mL (50 mg/mL) | Corning Mediatech | 30-005-CR | |
| 1.5 mL MCF tube | FisherBrand | 05-408-129 | |
| 3 mL 23gx1 injection needle with Luer lock | BD Safety Glide | 305905 | |
| 5 mL polystyrene round bottom tube with cell strainer cap | Corning Falcon | 352235 | |
| Methocel MC | Sigma-Aldrich | 64630 | |
| 14 mL Polystyrene round bottom tube | Corning Falcon | 352057 | |
| 10 mm polystyrene easygrip Petri dish | Corning Falcon | 351008 | |
| Librease TM | Roche Sigma-Aldrich | 5401119001 | dissociation protease |
| Pronase | Roche Sigma-Aldrich | 11459643001 | dechorionation protease |
| 15 cm Petri dish | Corning Falcon | 351058 | |
| AB | Zebrafish International Resource Center (ZIRC) | ZL1 | zebrafish strain used |
| Dithiolthreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 646563 |
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