CRISPR/Cas9-मध्यस्थता एक समरूपता-मध्यस्थ अंत में शामिल होने की रणनीति का उपयोग कर Vivo में लक्षित एकीकरण
Summary
संकुल नियमित रूप से प्रतिरिक्ति लघु palindromic दोहराता/CRISPR जुड़े प्रोटीन 9 (CRISPR/Cas9) प्रणाली आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए एक आशाजनक उपकरण प्रदान करता है, और transgenes के लक्षित एकीकरण की संभावना को खोलता है । हम एक समरूपता-मध्यस्थता अंत में शामिल होने का वर्णन (HMEJ)-आधारित रणनीति vivo में कुशल डीएनए लक्षित एकीकरण के लिए और लक्षित जीन CRISPR का उपयोग कर चिकित्सा/Cas9.
Abstract
एक होनहार जीनोम संपादन मंच के रूप में, CRISPR/Cas9 प्रणाली कुशल आनुवंशिक हेरफेर के लिए महान क्षमता है, विशेष रूप से transgenes के लक्षित एकीकरण के लिए । हालांकि, मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन) और गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होने के विभिंन indel उत्परिवर्तनों की कम दक्षता के कारण (NHEJ)-गैर-विभाजन कोशिकाओं में आधारित रणनीतियों, vivo जीनोम संपादन में एक बड़ी चुनौती बनी हुई है । यहां, हम एक समरूपता मध्यस्थता अंत में शामिल होने का वर्णन (HMEJ)-आधारित CRISPR/Cas9 प्रणाली vivo सटीक लक्षित एकीकरण में कुशल के लिए. इस प्रणाली में, लक्षित जीनोम और दाता वेक्टर समरूपता शस्त्र युक्त (~ 800 बीपी) एकल गाइड आरएनए (sgRNA) लक्ष्य अनुक्रम द्वारा पार्श्व CRISPR/Cas9 द्वारा सट रहे हैं । यह HMEJ आधारित रणनीति माउस zygotes में कुशल transgene एकीकरण, साथ ही vivo मेंहेपैटोसाइट्स में प्राप्त होता है । इसके अलावा, एक HMEJ आधारित रणनीति fumarylacetoacetate hydrolase के सुधार के लिए एक कुशल दृष्टिकोण प्रदान करता है (फह) हेपैटोसाइट्स में उत्परिवर्तन और बचाता है फह-कमी प्रेरित जिगर की विफलता चूहों । एक साथ ले लिया, लक्षित एकीकरण पर ध्यान केंद्रित, इस HMEJ आधारित रणनीति आनुवंशिक रूप से संशोधित पशु मॉडल और लक्षित जीन चिकित्सा की पीढ़ी सहित आवेदनों की एक किस्म के लिए एक आशाजनक उपकरण प्रदान करता है ।
Introduction
सटीक, लक्षित जीनोम संपादन अक्सर आनुवंशिक रूप से संशोधित पशु मॉडल और नैदानिक उपचार के उत्पादन के लिए आवश्यक है । बहुत प्रयास कुशल लक्षित जीनोम संपादन, जिंक फिंगर nuclease (ZFN), प्रतिलेखन उत्प्रेरक जैसे प्रभाव nucleases (TALENs), और CRISPR/Cas9 प्रणालियों के रूप में के लिए विभिंन रणनीतियों को विकसित करने के लिए किया गया है । इन रणनीतियों के जीनोम में लक्षित डीएनए डबल-किनारा टूटता है (DSB) बनाने के लिए, और आंतरिक डीएनए की मरंमत प्रणाली का लाभ ले, जैसे मुताबिक़ पुनर्संयोजन (मानव संसाधन)1,2, microhomology-मध्यस्थता अंत में शामिल होने (MMEJ)3 , 4 , 5, और गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने (NHEJ)6,7,8 के लक्षित एकीकरण प्रेरित करने के लिए transgenes1,9। मानव संसाधन आधारित रणनीति वर्तमान में सबसे अधिक इस्तेमाल किया जीनोम संपादन दृष्टिकोण है, जो सेल लाइनों में बहुत ही कुशल है, लेकिन देर S/G2 चरण में अपनी प्रतिबंधित घटना के कारण गैर-विभाजित कोशिकाओं के लिए आसानी से सुलभ नहीं है । इस प्रकार, मानव संसाधन आधारित रणनीति vivo जीनोम संपादन में के लिए लागू नहीं है । हाल ही में, NHEJ आधारित रणनीति कुशल जीन दस्तक के लिए माउस के ऊतकों में8में विकसित किया गया था । फिर भी, NHEJ आधारित विधि आमतौर पर जंक्शनों पर indels परिचय, यह मुश्किल सटीक जीनोम संपादन उत्पंन करने के लिए, खासकर जब में फ्रेम संलयन जीन8का निर्माण करने की कोशिश कर रहा । MMEJ आधारित लक्षित एकीकरण सटीक जीनोम संपादन करने में सक्षम है । हालांकि, यह केवल विनय पिछले रिपोर्ट5में लक्षित एकीकरण दक्षता बढ़ जाती है । इसलिए, vivo में सटीक लक्षित एकीकरण की दक्षता में सुधार तत्काल व्यापक चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए3की जरूरत है ।
हाल ही में प्रकाशित एक काम में, हम एक समरूपता-मध्यस्थता अंत में शामिल होने का प्रदर्शन किया (HMEJ) आधारित रणनीति है, जो सभी विट्रो में और vivo मेंदोनों की रिपोर्ट की रणनीतियों में उच्चतम लक्षित एकीकरण दक्षता दिखाया10। यहां, हम HMEJ प्रणाली की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, और भी एकल गाइड आरएनए (sgRNA) वैक्टर ब्याज की जीन लक्ष्यीकरण और दाता वैक्टर sgRNA लक्ष्य साइटों और समरूपता हथियारों के ~ 800 बीपी को लक्षित करने का निर्माण (चित्रा 1) . इस प्रोटोकॉल में, हम भी डीएनए में चूहे की पीढ़ी के लिए विस्तृत कदम का वर्णन-चूहों में और vivo मेंऊतकों में लक्षित एकीकरण के लिए संक्षिप्त कदम. इसके अलावा, HMEJ आधारित रणनीति के एक सबूत-अवधारणा के अध्ययन के फह उत्परिवर्तन और बचाव फहसही करने के लिए अपनी क्षमता का प्रदर्शन किया– -जिगर की विफलता चूहों, जो आगे अपनी चिकित्सीय क्षमता से पता चला.
Protocol
Representative Results
Discussion
HMEJ दाता plasmids के निर्माण में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: (1) उच्च डीएनए दरार दक्षता और sgRNA काटने साइट और स्टॉप codon के बीच कम दूरी के साथ sgRNA का चयन, और (2) HMEJ दाता का उचित निर्माण । CRISPR/Cas9-दोनों transgene दाता सदिश पर मध्यस्थता दर?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कैस रणनीतिक प्राथमिकता अनुसंधान कार्यक्रम (XDB02050007, XDA01010409), नेशनल Hightech आर एंड डी कार्यक्रम (863 कार्यक्रम; 2015AA020307), चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (NSFC अनुदान ३१५२२०३७, ३१५००८२५, ३१५७१५०९, के द्वारा समर्थित किया गया था, ३१५२२०३८), चीन युवा हजार प्रतिभा कार्यक्रम (HY करने के लिए), चीनी विज्ञान अकादमी के परियोजना के माध्यम से तोड़, शंघाई सिटी साइंस और प्रौद्योगिकी परियोजना (16JC1420202 HY) की समिति, चीन के विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (MOST; 2016YFA0100500) ।
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
Referências
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