Guidade protokoll för fekal mikrobiell karakterisering av 16S rRNA-amplikon sekvensering
Summary
Detta manuskript beskriver en detaljerad standardiserade protokollet av hög genomströmning 16S rRNA-amplikon sekvensering. Protokollet införs ett integrerat, uniformerad, genomförbart och billig protokoll från fekal provtagning genom dataanalyser. Detta protokoll möjliggör analys av stora mängder prover med stränga normer och flera kontroller.
Abstract
Den mänskliga tarmen mikrobiomet spelar en central roll i att skydda celler från skada, i bearbetning av energi och näringsämnen och att främja immunitet. Avvikelser från vad som anses vara en hälsosam bakterieflora sammansättning (dysbios) kan försämra vitala funktioner leder till patologiska förhållanden. Senaste och pågående forskningsinsatser har varit riktad mot karakterisering av associationer mellan mikrobiell komposition och människors hälsa och sjukdom.
Framsteg i hög genomströmning sekvensering teknik gör det möjligt för karakterisering av gut mikrobiella sammansättningen. Dessa metoder inkluderar 16S rRNA-amplikon sekvensering och shotgun sekvensering. 16s rRNA-amplikon sekvensering används för att profilera mångfaldskonventionen sammansättning, medan shotgun sekvensering ger ytterligare information om genen förutsägelser och funktionella anteckning. En fördel med en riktad sekvensering metod för regionen 16S rRNA-genen på variabel är dess betydligt lägre kostnad jämfört med shotgun sekvensering. Sekvens skillnader i 16S rRNA-genen används som en mikrobiell fingeravtryck att identifiera och kvantifiera olika taxa inom ett enskilt prov.
Stora internationella insatser har värvat standarder för 16S rRNA-amplikon sekvensering. Flera studier rapporterar dock en vanlig källa till variation som orsakas av batch effekt. För att minimera denna effekt, uniformerade protokoll för provtagning, måste bearbetning och sekvensering genomföras. Detta protokoll föreslår en integrering av i stort sett använda protokollen från fekal provtagning till dataanalyser. Detta protokoll innehåller en kolumn-fri, direkt-PCR-metod som möjliggör samtidig hantering och DNA-extraktion av stora mängder fecal prov, tillsammans med PCR-amplifiering av regionen V4. Dessutom protokollet beskriver rörledningen analys och ger ett manus som använder den senaste versionen av QIIME (QIIME 2 version 2017.7.0 och DADA2). Denna stegvisa protokollet syftar till att vägleda dem intresserade av att inleda användning av 16S rRNA-amplikon sekvensering i ett robust, reproduktiva, lätt att använda, detaljerade sätt.
Introduction
Koncentrerad ansträngningar har gjorts för att bättre förstå mikrobiomet mångfald och överflöd, som en annan aspekt av att fånga skillnad och likheter mellan individer i friska och patologiska förhållanden. Ålder2,3, geografi4, livsstil5,6och sjukdom5 visade sig vara associerade med sammansättningen av de gut microbiom, men många villkor och populationer har ännu inte fullt kännetecknas. Det har nyligen rapporterats att mikrobiomet kan ändras för terapeutiska tillämpningar7,8,9. Ytterligare insikt i förhållandet mellan olika fysiologiska förhållanden och mikrobiella sammansättningen därför det första steget mot optimering av potentiella framtida ändringar.
De traditionella mikrobiella kultur metoderna begränsas av låg avkastning10,11, och är conceptualized som ett binärt tillstånd där en bakterie är antingen presentera i tarmen eller inte. Hög genomströmning DNA-baserade sekvensering har revolutionerat mikrobiell ekologi, aktivera tillfångatagandet av alla medlemmar i mikrobiell gemenskapen. Men läsa sekvens längd och kvalitet är fortfarande betydande hinder för korrekta taxonomin tilldelning12. Dessutom kan hög genomströmning baserat experiment lida av batch effekter, där mätningar påverkas av icke-biologiskt eller icke-vetenskapliga variabler13. Under de senaste åren har flera program fastställts för att studera den mänskliga microbiom, inklusive amerikanska Gut projektet, Förenta staterna (USA) Human mikrobiomet Project och Förenade kungariket (Storbritannien) MetaHIT projektet. Dessa initiativ har genererat enorma mängder data som inte är enkelt jämförbara på grund av bristande konsekvens i sina metoder. En mängd internationella projekt såsom internationella mänskliga mikrobiomet konsortiet, det internationella mänskliga mikrobiomet Standards projektet, och National Institute of Standards och Technology (NIST) försökte ta dessa frågor14 , och utvecklat standarder för mikrobiomet mätningar som bör göra det möjligt att uppnå tillförlitlig reproduktiv resultat. Beskrivs här är en integrerad protokoll flera metoder i huvudsak använts15,16 för 16S rRNA hög genomströmning sekvensering (16S-seq) start från fekal provtagning thru dataanalyser. Protokollet beskrivs en kolumn-fri PCR-metoden, ursprungligen avsedd för direkt utvinning av växt DNA16, aktivera samtidig hantering av stora mängder fecal prov i en relativt kort tid med hög kvalitet förstärkt DNA för riktad sekvensering av regionen för mikrobiell V4 för variabel på en gemensam plattform för sekvensering. Detta protokoll syftar till att vägleda forskare intresserade av att inleda användning av 16S rRNA-amplikon sekvensering i ett robust, reproduktiva, lätt att använda, detaljerade sätt, med hjälp av viktiga kontroller. Att ha en guidad och detaljerade steg-för-steg-protokollet kan minimera batch effekt och därmed kommer att tillåta mer jämförbara sekvensering resultat mellan labs.
Protocol
Representative Results
Discussion
16s rRNA-amplikon och metagenomik shotgun sekvensering har vunnit popularitet i klinisk mikrobiologi program21,22,23. Dessa tekniker är fördelaktigt i deras ökade förmåga att fånga odlingsbara och icke-odlingsbara taxa, som tillhandahåller data om det relativa överflödet av de patogena inokulatet och deras förmåga att identifiera mer exakt en polymikrobiella smittsamma Fingerprint24. Framsteg inom mikrobiomet forskningsområdet …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds delvis av programmet jag-CORE (bidrag nr 41/11), Stiftelsen Israel vetenskap (grant nr 908/15), och Europeiska Crohns och kolit organisation (ECCO).
Materials
| Primers | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
| Extraction solution | Sigma-Aldrich | E7526 | |
| Dilution solution | Sigma-Aldrich | D5688 | |
| Kapa HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit | KAPABIOSYSTEMS | KK2601 | PCR Master mix |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent kit | Invitrogen | P7589 | dsDNA quantify reagent |
| MinElute Gel extraction kit | Qiagen | 28606 | |
| Agarose | Amresco | 0710-250G | |
| Ultra Pure Water Dnase and Rnase Free | Biological Industries | 01-866-1A | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Molecular probes | Q32854 | dsDNA detecting kit |
| High Sensitivity D1000 | Agilent Technologies | Screen Tape 5067-5582 | separation and analysis |
| Screen Tape Assay | Agilent Technologies | Reagents 5067-5583 | for DNA libraries |
| PhiX Control v3 | Illumina | 15017666 | control library |
| MiSeq Reagent Kit v2 (500 cycle) | Illumina | MS-102-2003 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | E406-10mL-TAM | |
| 2 mL collection tubes | SARSTEDT | 72.695.400 | Safe Seal collection tubes |
| Plastic stick swab in PP test tube | STERILE INTERIOR | 23117 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| PCR Machine | Applied Biosystems | 2720 Thermal Cycler | |
| Sequncing Machine | Illumina | Miseq | |
| PCR workstation | Biosan | UV-cleaner | |
| scissors | |||
| vortexer | Scientific Industries | Vortex-Genie 2 |
Referências
- Braun, T., et al. Fecal microbial characterization of hospitalized patients with suspected infectious diarrhea shows significant dysbiosis. Scientific Reports. 7, 1088 (2017).
- De Filippo, C., et al. Impact of diet in shaping gut microbiota revealed by a comparative study in children from Europe and rural Africa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 14691-14696 (2010).
- Yatsunenko, T., et al. Human gut microbiome viewed across age and geography. Nature. 486, 222-227 (2012).
- Rodriguez, J. M., et al. The composition of the gut microbiota throughout life, with an emphasis on early life. Microbial Ecology in Health and Disease. 26, 26050 (2015).
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- McDonald, D., et al. An improved Greengenes taxonomy with explicit ranks for ecological and evolutionary analyses of bacteria and archaea. The ISME Journal. 6, 610-618 (2012).
- Bakken, J. S., et al. Treating Clostridium difficile infection with fecal microbiota transplantation. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 9, 1044-1049 (2011).
- Khoruts, A., Dicksved, J., Jansson, J. K., Sadowsky, M. J. Changes in the composition of the human fecal microbiome after bacteriotherapy for recurrent Clostridium difficile-associated diarrhea. Journal of Clinical Gastroenterology. 44, 354-360 (2010).
- Nood, E. V., et al. Duodenal infusion of donor feces for recurrent Clostridium difficile. The New England Journal of Medicine. 368, 407-415 (2013).
- Koplan, J. P., Benfari Ferraro, M. J., Fineberg, H. V., Rosenberg, M. L. Value of stool cultures. The Lancet. 316, 413-416 (1980).
- Platts-Mills, J. A., Liu, J., Houpt, E. R. New concepts in diagnostics for infectious diarrhea. Mucosal Immunology. 6, 876-885 (2013).
- Bokulich, N. A., et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing. Nature Methods. 10, 57-59 (2013).
- Leek, J. T., et al. Tackling the widespread and critical impact of batch effects in high-throughput data. Nature Reviews Genetics. 11, (2010).
- Dubilier, N., McFall-Ngai, M., Zhao, L. Create a global microbiome effort. Nature. 526, 631-634 (2015).
- Caporaso, J. G., et al. Global patterns of 16S rRNA diversity at a depth of millions of sequences per sample. PNAS. 108, 4516-4522 (2011).
- Flores, G. E., Henley, J. B., Fierer, N. A direct PCR approach to accelerate analyses of human-associated microbial communities. PloS One. 7, (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Callahan, B. J., et al. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nature Methods. 13, 581-583 (2016).
- Lozupone, C., Knight, R. UniFrac: A new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology. 71, 8228-8235 (2005).
- Lozupone, C., Lladser, M. E., Knights, D., Stombaugh, J., Knight, R. UniFrac: An effective distance metric for microbial community comparison. The ISME Journal. 5, 169-172 (2011).
- Srinivasan, R., et al. Use of 16S rRNA gene for identification of a broad range of clinically relevant bacterial pathogens. PloS One. 10, e0117617 (2015).
- Hiergeist, A., Gläsner, J., Reischl, U., Gessner, A. Analyses of intestinal microbiota: culture versus sequencing. ILAR Journal. 56, 228-240 (2015).
- Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nature Reviews Genetics. 13, 601-612 (2012).
- Salipante, S. J., et al. Rapid 16S rRNA next-generation sequencing of polymicrobial clinical samples for diagnosis of complex bacterial infections. PloS One. 8, e65226 (2013).
- Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. The ISME Journal. 6, 1621-1624 (2012).
