Indfange interaktion kinetik af en Ion-kanal Protein med små molekyler af Bio-lag interferometri Assay
Summary
Protokol her beskriver renset hEAG1 ion-kanal protein interaktioner med lille molekyle lipid ligand phosphatidylinositol 4, 5-bisfosfat (PIP2). Målingen viser, at BLI kunne være en potentiel metode til romanen små-molekyle ion-kanal ligand screening.
Abstract
Bio-lag interferometri (BLI) assay er et værdifuldt redskab til måling af protein-protein og protein-lille molekyle interaktioner. Her, vi først beskrive anvendelsen af denne roman etiket-gratis teknik til at studere samspillet mellem menneskelige EAG1 (hEAG1) kanal proteiner med lille molekyle PIP2. hEAG1 kanal er blevet anerkendt som potentielle terapeutiske mål på grund af dets afvigende overekspression i kræft og få gevinst af funktion mutationer involveret i nogle typer af neurologiske sygdomme. Vi renset hEAG1 kanal proteiner fra et pattedyr stabil ekspressionssystem og målt interaktion med PIP2 af BLI. Vellykket måling af kinetik af binding mellem hEAG1 protein og PIP2 viser, at BLI assay er en potentiel høj overførselshastighed tilgang anvendes til nye små-molekyle ligand screening i ion-kanal farmakologi.
Introduction
Målretning celle overflade-tilgængelige ion-kanal proteiner med små molekyler giver et enormt potentiale for ligand screening og biologiske drug discovery1,2,3. Således, en passende værktøj er nødvendig for at studere samspillet mellem ion-kanal og små molekyler og deres tilsvarende funktion. Patch-clamp optagelse har vist sig for at være en enestående og uerstattelige teknik i ion-kanal funktionelle analyse. Dog fastslå, om de små molekyler direkte målrette Ionkanaler kræver andre teknologier. Traditionelt, blev radioaktive ligand bindende assay brugt til at observere kinetik af binding mellem lille molekyle og dens mål ion-kanal protein. Brugen af denne teknik er dog begrænset på grund af dens krav i radioaktive mærkning og registrering. Desuden forhindrer de forudsætning skridt til at mærke de små ligand i undersøgelsen, dens bruger i mange typer af Ionkanaler uden kendte specifikke ligand. Nogle etiket-fri teknikker såsom NMR spektroskopi, røntgen diffraktion, individuel thermophoresis (MST)4 og overflade plasmon resonans (SPR) har været brugt til at måle de protein-lille molekyle interaktioner. Men disse typer af assays normalt ikke kan give tilstrækkelige oplysninger på grund af vanskeligheder ved at få fuld længde protein, lav opløsning af dynamics, lav overførselshastighed og høje omkostninger5. I modsætning til disse teknikker fremstår bio-lag interferometri (BLI) som en roman etiket-fri metode til at overvinde disse ulemper til påvisning af protein-lille molekyle interaktioner ved immobilisere et bittesmå mængder af protein prøve på overflader biosensor og måling af den optiske skiftende signaler6,7. Som en lovende biosensor platform, BLI teknik er allerede udført for at observere samspillet mellem små molekyler med naturlig vand opløselige proteiner som et humant monoklonalt antistof CR80208 og den detaljerede analyseprocedure er blevet rapporteret i en tidligere artikel9. Selvom nøglerolle ion-kanal protein for nye terapeutiske mål opdagelse er blevet anerkendt, ion-kanal protein-lille molekyle interaktion analysen baseret på BLI ikke er blevet beskrevet.
Menneskelige Ether à go-go kanaler (hEAG1) er udtrykt i forskellige typer af kræftceller og centrale nervesystem, hvilket gør kanal a potentielle terapeutiske mål for mange kræftformer og neuronale forstyrrelser10,11, 12,13,14. Den elektrofysiologiske undersøgelse i vores lab har bekræftet den hæmmende effekt af phosphatidylinositol 4, 5-bisfosfat (PIP2) på hEAG1 kanal15. Baseret på vores resultater, test PIP2 direkte interaktion med hEAG1 ved hjælp af BLI teknik kan være et forbillede for andre typer af ion-kanal protein-lille molekyle sammensat interaktion især for de kanaler, der mangler specifikke ligander. Henhold til instruktionerne BLI assay, vi forberedte biotinylated hEAG1 proteiner og immobiliseret dem på overfladen af streptavidin (SA) biosensor tips efterfulgt af interaktion dem til PIP2 løsninger at observere deres direkte bindende mellem den protein og lipid. Efter udlæg i PIP2 hEAG1 protein coated overflade, tykkelse af lag på overfladen øger, som direkte korrelerer den spektrale Skift og kan måles i real-time16. Bindende kinetik kan bestemmes på grund af en positiv forskydning i foreningen trin og en negativ forskydning i dissociation trin. Ifølge dette princip vi renset funktionelle hEAG1 ion-kanal protein fra HEK-239T stabil udtryk system ved hjælp af affinitet rensning metode til at opretholde den in vitro- funktionelle tilstand, derefter målt kinetik af bindingen af forskellige koncentration PIP2, og gav en semblable kinetiske data som observeret i elektrofysiologiske målinger15. Tæt korrespondancen mellem resultaterne fra BLI og elektrofysiologiske målinger viser for første gang BLI egnethed som et relevant analytisk værktøj for ion-kanal membran protein-lille molekyle interaktion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Membran Ionkanaler er blevet bekræftet som de primære terapeutiske mål på over 13% af aktuelt kendte lægemidler til behandling af en lang række sygdomme, herunder hjerte-kar- og neurologiske lidelser18. Patch-klemme optagelse, har den gyldne standard for måling af de funktionelle Ionkanaler med små molekyler, været meget anvendt for ion-kanal ligander screening. Dog kan ikke sådan elektrofysiologiske metoder påvise om de små molekyler bindes til kanal direkte eller ikke<sup class="xref…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Bio-ID Center og SJTU tværfaglig forskningsfond i medicin og teknik (YG2016QN66), National Natural Science Foundation of China (31271217) og nationale grundlæggende forskning Program af Kina (2014CB910304).
Materials
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
Referências
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Bioquímica. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?. Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
