Vastleggen van de kinetiek van de interactie van een ionkanaal eiwit met kleine moleculen door de Bio-laag interferometrie Assay
Summary
Het protocol hier beschrijft de interacties van gezuiverde hEAG1 ion kanaal eiwit met de kleine molecuul lipide ligand phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2). De meting toont aan dat BLI zou een mogelijke methode voor nieuwe kleine-molecuul ion kanaal ligand screening.
Abstract
De bio-laag interferometrie (BLI) bepaling is een waardevol instrument voor het meten van de eiwit-eiwit en eiwit-kleine molecule interacties. Hier beschrijven we eerst de toepassing van dit nieuwe etiket-vrije techniek op de studie van de interactie tussen menselijke EAG1 (hEAG1) kanaal eiwitten met de kleine molecuul PIP2. hEAG1 kanaal is erkend als potentieel therapeutisch doel vanwege zijn afwijkende overexpressie in kanker en enkele winst-van-functie mutaties die betrokken zijn bij sommige soorten neurologische ziekten. We gezuiverd hEAG1 kanaal eiwitten uit een zoogdieren stabiele expressie-systeem en de interactie met PIP2 door BLI gemeten. De succesvolle meting van de kinetiek van de binding tussen hEAG1 eiwit en PIP2 toont aan dat de bepaling BLI een potentiële hoge gegevensdoorvoer aanpak gebruikt voor nieuwe kleine-molecuul ligand screening in ion kanaal farmacologie is.
Introduction
Gericht op de cel met kleine moleculen aan de oppervlak-toegankelijk ion kanaal eiwitten biedt een enorm potentieel voor de ligand screening en biologische drug discovery1,2,3. Zo nodig een passend instrument is voor de studie van de interactie tussen ionkanaal en kleine moleculen en hun corresponderende functies. De patch-clamp-opname heeft aangetoond een uniek en onvervangbaar techniek in ion kanaal functionele assay. Bepalen of de kleine molecules rechtstreeks richten ionenkanalen echter andere technologieën. Traditioneel, werd de radioactieve ligand bindende bepaling gebruikt voor het observeren van de kinetiek van de binding tussen klein molecuul en haar doel ion kanaal eiwit. Het gebruik van deze techniek is echter beperkt vanwege haar eis in radioactieve labeling en detectie. Bovendien, voorkomt de vereiste stap naar het label van de kleine ligand in de studie zijn gebruikt in vele soorten ionenkanalen zonder bekende specifieke ligand. Sommige label-vrije technieken zoals NMR spectroscopie, X-ray diffractie, microscale thermophoresis (MST)4 en oppervlakte plasmon resonantie (SPR) werden gebruikt voor het meten van de eiwit-kleine molecule interacties. Maar dit soort tests meestal niet voldoende informatie kunt verstrekken vanwege de moeilijkheid om de full-length eiwit, lage resolutie van dynamiek, lage doorvoersnelheid en hoge kosten5. In tegenstelling tot deze technieken, bio-laag Interferometry (BLI) ontpopt zich als een nieuwe label-vrije methodologie te overwinnen deze nadelen voor het opsporen van eiwit-kleine molecule interacties door immobilizing van een kleine hoeveelheid eiwitSteekproef op de oppervlakken van biosensor en het meten van de optische veranderende signalen6,7. Als een veelbelovende biosensor platform, BLI techniek is al uitgevoerd om te zien hoe de interactie van kleine moleculen met natuurlijke water oplosbare eiwitten zoals een menselijke monoklonale antistof CR80208 en de gedetailleerde bepaling procedure heeft gemeld in een vorige artikel9. Hoewel de belangrijke rol van ion kanaal eiwitten voor nieuwe therapeutische doelen ontdekking heeft erkend, is de ion kanaal eiwit-kleine molecule interactie bepaling op basis van BLI niet beschreven.
De mens Ether à go-go kanalen (hEAG1) worden uitgedrukt in verschillende types van kankercellen en centrale zenuwstelsel, waardoor het kanaal a potentiële therapeutische doel van veel kankers en neuronale stoornissen10,11, 12,13,14. Het elektrofysiologische studie in ons lab heeft bevestigd dat de remmende werking van phosphatidylinositol 4, 5-difosfaat (PIP2) op hEAG1 kanaal15. Op basis van onze resultaten, PIP2 testen direct interactie met de hEAG1 met behulp van BLI techniek kan worden als een model voor andere soorten ion kanaal eiwit-kleine molecule samengestelde interactie met name voor die kanalen ontbreken van specifieke liganden. Volgens de instructies van BLI assay, wij bereid biotinyleerd hEAG1 eiwitten en geïmmobiliseerd hen op het oppervlak van daar (SA) biosensor tips gevolgd door interactie hen naar PIP2 oplossingen voor het observeren van hun directe binding tussen de eiwitten en de lipide. Na het aanbrengen van PIP2 op het gecoate oppervlak van hEAG1 eiwit, de dikte van de laag aan de oppervlakte toeneemt, die direct correleert de spectrale verschuiving en kan worden gemeten in real-time16. De bindende kinetiek kan worden bepaald als gevolg van een positieve verschuiving in vereniging stap en een negatieve verschuiving in dissociatie stap. Volgens dit principe, we gezuiverd van het functionele hEAG1 ion kanaal eiwit van HEK-239T stabiele expressie systeem met behulp van affiniteit zuivering methode de functionele toestand in vitro te handhaven, dan de kinetiek van de binding van gemeten verschillende concentratie PIP2, en leverde een semblable kinetische gegevens zoals waargenomen in elektrofysiologische metingen15. De nauwe correspondentie tussen de resultaten van de BLI en elektrofysiologische metingen tonen voor het eerst de geschiktheid van BLI als een passende analytische tool voor ion kanaal membraan eiwit-kleine molecule interactie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ionenkanalen van de membraan zijn geverifieerd als de primaire therapeutische doelen van meer dan 13% van de op dit moment bekende medicijnen voor de behandeling van een verscheidenheid van ziekten bij de mens, met inbegrip van cardiovasculaire en neurologische stoornissen18. Patch-clamp opnemen, is de gouden standaard voor het meten van de functionele van ionenkanalen met kleine molecules, wijd verbeid gebruikt voor ion kanaal liganden screening. Echter niet kunnen dergelijke elektrofysiologische…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Bio-ID Center en SJTU Cross-disciplinair onderzoeksfonds in geneeskunde en Engineering (YG2016QN66), National Natural Science Foundation of China (31271217), en nationale Basic Research programma van China (2014CB910304).
Materials
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
Referências
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Bioquímica. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?. Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
