定量实时反转录 PCR 技术对猕猴猴血浆 MicroRNA 水平的绝对量化
Summary
本报告描述了一种测量血浆 miRNA 绝对水平的协议, 使用定量的实时反向转录 PCR 或不预放大。该议定书对血浆 miRNAs 的数量有了更好的了解, 并允许对来自不同研究或实验室的相应数据进行定性评估。
Abstract
qPCR 是评估个体目标 miRNAs 的最常用方法之一。MiRNAs 水平通常是相对于参考样本进行测量的。这种方法适用于检查目标基因表达水平的生理变化。然而, 使用更好的统计分析进行绝对量化, 对基因表达水平的综合评估是可取的。绝对量化仍然没有共同使用。本报告描述了一种用于测量血浆 miRNA 绝对水平的协议, 使用的是带有或不具有预放大的 qPCR。
从有意识猕猴猴股静脉收集的血液中制备了一定量 (200 µL) EDTA 血浆 (n = 50)。利用商用系统提取总 RNA。以探针为基础的 qPCR 检测方法对血浆 miRNAs 进行量化, 其中含有 miRNA 特异的正向/反向 PCR 底漆和探针。利用商用合成 RNA 寡核苷酸生成绝对量化的标准曲线。合成 cel-miR-238 被用作标准化和质量评估的外部控制。在 qPCR 步骤之前, 显示量化周期 (miRNAs) 值超过35的数据是预放大的。
在检查的 8 miRNAs 中, miR-122、miR-133a 和 miR-192 没有预放大, 而 miR-1、miR-206 和 miR-499a 需要预放大, 因为它们的表达水平较低。MiR-208a 和 miR-208b 在预扩后都无法检测到。用尖刺 cel-miR-238 的取值评价样品的加工效率。在这种检测方法中, 技术变异估计小于3倍, 量化的下限 (LLOQ) 为 102拷贝/µL, 对于大多数被检查的 miRNAs。
该协议提供了一个更好的估计血浆 miRNAs 的数量, 并允许质量评估的相应数据从不同的研究。考虑到体液中 miRNAs 的数量较少, 预扩有助于提高对表达不良 miRNAs 的检测。
Introduction
越来越多的研究一直在探索 microRNAs (miRNAs) 作为癌症诊断和预后的标志物, 或监测和检测其他疾病的有意和临床研究1,2,3.定量实时反向转录 PCR (RT qPCR) 是评估单个目标 miRNAs 最常用的方法之一, 因为该技术比微阵列4和基于 RNA 排序的平台5更敏感。通常, miRNA 表达式是使用ΔCq 方法6来相对于引用示例进行度量的。这种方法适合于研究目标基因表达水平的生理变化。然而, 相对量化的循环 miRNAs 的效用有限, 因为它们的数量很小。此外, 技术的变化使得很难比较不同研究的结果, 因为不同的实验室对 RT qPCR 实验协议进行了不同的定制, 从而导致不一致甚至矛盾的结果从不同的研究7。
鉴于上述关注, 绝对量化可能更适合于评估体液中微量的 miRNAs。绝对量化方法使用由已知的合成 RNA 寡核苷酸所产生的标准曲线, 其顺序与相应的目标 miRNA8相同。卫生和环境科学研究所 (何思) 基因组学技术委员会最近进行了综合研究, 以比较在多个试验场的等离子 miRNAs 的绝对测量结果。结果表明, 使用标准协议进行绝对定量的 miRNAs 在多个测试站点9中产生了可比较的结果。本研究所描述的 RT qPCR 法与何思的标准协议几乎相同, 包括多 miRNA 靶的复用分析和预放大, 以帮助检测低表达 miRNAs。
在本研究中, 从有意识的猕猴猴 (n = 50) 的股静脉收集的血液中制备的 EDTA 等离子体固定容积 (200 µL) 使用了10。下面的协议描述了制备血浆样品、提取 miRNA 和 qPCR 的过程, 包括预放大。更重要的是, 还包括了有关该协议的其他技术信息, 以使样品中的目标 miRNAs 数量能够与一个合格的流程相结合来验证。首先, 在生物样品定量化之前, 对每个 miRNA 的标准曲线进行了验证。其次, 利用外部控制 (cel-miR-238) 的值对当前方法的质量进行综合评价。因此, 这个平台提供了更多的信息和可靠的数据, 以比较不同的研究或实验室的结果。
本文介绍了 8 miRNAs 的概况, 作为本报告所述化验方法的代表性结果。这些 miRNAs 被建议作为潜在的安全生物标志物与组织损伤的肝脏 (miR-122 和 miR-192), 心脏 (miR-1, miR-208a, miR-208b 和 miR-499a), 骨骼肌肉 (miR-133a 和 miR-206) 在啮齿目动物和人3, 11,12,13。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们的综合评估对动态范围的范围提供了更严格的统计分析, 这清楚地表明, 在 miRNAs 测试中, 单个样品之间的变化幅度极不相同。虽然这些变化可能是由于其体液中的少量, 但应该指出, 这些数据不仅反映了生物的变化, 而且还体现了技术上的变化。大多数技术变化可以通过外部控制 (cel-miR-238) 的值来评估, 在其他检测平台18中使用。由于 miRNA 分析中没有标准化的内部控制, 因此在?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项研究没有得到公共、商业或非营利部门的资助机构的任何具体补助金。
Materials
| BD Microtainer tube (K2EDTA) | Becton, Dickinson and Company | 365974 | For blood collection |
| Eppendorf PCR Tubes, 0.2 mL | Eppendorf | 0030124359 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf Safe-Lock micro test tubes 2.0 mL | Eppendorf | 0030120094 | |
| Synthetic oligonucleotide | Hokkaido System Science | – | Individual miRNA (0.2 μmol,HPLC grade) |
| Tris-EDTA Buffer (pH 8.0) | Nippon Gene | 314-90021 | TE buffer |
| Buffer RPE | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Buffer RWT | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| miRNeasy Mini Kit | QIAGEN | 217004 | |
| Nuclease-Free Water | QIAGEN | 129114 | |
| QIAzol Lysis Reagent | QIAGEN | – | Contents in miRNeasy mini kit |
| Syn-cel-miR-238-3p miScript miRNA Mimic | QIAGEN | 219600 | ID:MSY0000293, 5 nmol |
| SC Adapters | TAIGEN Bioscience Corporation | S0120 | For RNA extraction |
| VacEZor 36 Complete System | TAIGEN Bioscience Corporation | M3610 | For RNA extraction |
| 7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4351405 | Fast 96-Well Block |
| GeneAmp PCR System 9700 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 9700 | |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4346907 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4311971 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4444557 | |
| TaqMan MicroRNA Assays (cel-miR-238-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000248 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-122-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002245 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-133a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002246 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-1-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002222 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-192-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000491 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-206) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000510 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208a-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 000511 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-208b-3p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 002290 |
| TaqMan MicroRNA Assays (hsa-miR-499a-5p) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4427975 | Assay ID: 001352 |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit |
Thermo Fisher Scientific Inc. | 4366597 | |
| TaqMan PreAmp Master Mix (2×) | Thermo Fisher Scientific Inc. | 4391128 | |
| Chloroform | Wako Pure Chemicals | 035-02616 | |
| Ethanol (99.5) | Wako Pure Chemicals | 057-00456 |
Referências
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